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細胞外囊泡(EV)被認為是用於各種基因治療的有前途的運載工具。它們是相對惰性的、非免疫原性的、可生物降解的和生物相容的。至少在齧齒動物中，它們甚至可以顺利获得具有挑戰性的身體障礙，例如血腦屏障。EV可以設計為攜帶和遞送治療分子，如蛋白質和RNA。因此，EV正在成為一種體內基因治療載體。近期，Mol Ther雜誌上發表一篇文章，對EV作為遞送載體的應用進行了概覽。韦德国际需要更深入地分析基本的EV生物學——包括細胞生產、EV加載、全身分佈和細胞遞送——以有效利用這些內源性細胞納米粒子作為下一代納米遞送工具。然而，即使是完美的EV產品也很難在臨床規模上生產。在這方面，作者建議可以使用載體轉導技術將細胞離體或直接體內轉化為EV工廠，以穩定、安全地調節基因表達和功能。作者從當前的EV最先進技術推斷出一個光明的潛在未來，即使用EV治療當前療法難以治療的遺傳疾病。

EV生物發生和治療遞送潛力

所有真核細胞都會釋放大量的細胞外囊泡(EV)：膜結合的納米顆粒，大致呈球形，直徑範圍在50至500 nm左右。EV多種多樣，不僅按大小分類，還按起源細胞、釋放模式、分子組成和功能分類。EV被認為在以下方面發揮作用顺利获得在細胞之間傳遞核酸、蛋白質、小分子和脂質來進行細胞間通訊，但也可以設想其他相互作用模式。值得注意的是，已觀察到這些分子在EV中運輸後在受體細胞中保留其功能，這表明含有活性蛋白質、RNA、蛋白質或DNA的EV可以改變遠離EV生產細胞的細胞生物學。這些特性賦予EV無與倫比的安全性和生物相容性潛力。迄今為止，一些治療性生物分子已被裝載到EV中並遞送至靶細胞，並在體外和體內模型進行了實驗驗證。

將治療性RNA加載到EV中

RNA療法與鋅指或CRISPR療法相比具有明顯的優勢，因為RNA顺利获得內源性細胞通路以瞬時方式發揮作用並且是可編程的，因此相對容易針對特定疾病進行工程改造，並且通常不具有免疫原性。已經發現和研究了具有生物學功能和治療潛力的各種RNA生物型，例如小干擾RNA(siRNA)，從而導致了新型治療藥物的開發。RNA可用於賦予短期瞬態和長期表觀遺傳沉默，這是基於目標，例如，靶向基因啟動子可以誘導轉錄基因沉默。值得注意的是，基於mRNA的疫苗現在也被有效地用於對抗COVID-19大流行。然而，儘管治療性RNA可以快速改變和產生，但它們必須達到預期目標才能有效。例如，Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗中使用了脂質納米顆粒(LNP)並用於治療針對肝臟的多發性神經病，但這些方法可能具有細胞毒性，在循環中不穩定，並且不適合輸送到其他組織。此外，基於RNA的藥物的細胞和亞細胞遞送也是一項艱巨的挑戰，只有不到1%的有效載荷到達細胞的胞質溶膠。潛在地，將這些RNA包裝到天然攜帶RNA的EV中，可能是一種更安全且更具生理針對性的方法。因此，已經進行了多種嘗試以將RNA整合到EV中並優化包裝和釋放效率。

將mRNA包裝到EV中

雖然EV正在成為一種有前途的遞送系統，但事實證明，將治療貨物有效地裝載到EV中具有挑戰性。EV可以在生物發生過程中或在使用物理或化學方法分離EV後自然加載。電穿孔已用於將核酸加載到EV中，但是，這會破壞EV膜的內在特性並導致大量EV損失。因此，將mRNA加載到EV中的最常見方法是用編碼治療性mRNA的質粒轉染EV生產細胞。由此產生的高濃度細胞質mRNA足以將mRNA包裝到EV中，這可能是因為已經發現EV可以功能性地輸出大量過剩的細胞成分。

將RNA加載到EV中的另一種方法是生成脂質包被的RNA顆粒，並顺利获得混合誘導的分區將這些顆粒整合到純化的EV中。正如預期的那樣，此過程會導致EV尺寸略有增加和EV數量減少，但它是高效且準確的(>90%)。然而，需要用脂質預包被RNA會帶來費用和時間限制以及純化。因此，雖然此過程可用於研究目的，但要擴展到臨床或商業應用可能具有挑戰性。

將shRNA、miRNA和circRNA包裝到EV中

眾所周知，微小RNA(miRNA)會加載到EV中，並在功能上調節其他受體細胞類型中的基因表達。這可能是顺利获得與Argonaut2(AGO2)的直接相互作用實現的，後者已被發現被包裝到EVs中。或者，特定的蛋白質，如YBX1與將特定的miRNAs加載到EVs中有關，而其他人則認為可能沒有是參與EVs的miRNA募集的特定基序或途徑。還有一些人發現似乎沒有特定的miRNA包裝系統可以將這些RNA加載到EVs中。由於其靶基因範圍相對較大，miRNA可以顯著改變細胞的表型或基因表達，因此它們可能是一種具有促進、觸發或治療疾病潛力的高價值貨物。

正如EV加載的miRNA通訊通路的存在所證明的那樣，相對於其他RNA類型，miRNA似乎優先加載到EV中，這表明細胞內存在內源加載系統。AGO2是一種RNA結合蛋白，可結合miRNA，可能負責EVs中的miRNA加載。由於它們在EV中具有深遠的調節潛力和天然存在性，miRNA和AGO2結合小髮夾RNA(shRNA)似乎是EV治療的理想候選者。在EV中觀察到的另一類調節RNA是環狀RNA(circRNA)。CircRNA是一類單鏈環狀非編碼RNA，由mRNA中外顯子的反向剪接產生。已觀察到一些基因表達的circRNA數量是蛋白質編碼mRNA的數倍，表明其具有重要的功能作用，包括顺利获得吸收miRNA進行轉錄調節、與蛋白質相互作用、與pre-mRNA剪接競爭，以及很少作為模板用於蛋白質翻譯。缺少5'和3'末端可保護circRNA免於被核酸外切酶降解，這最終使這些轉錄本在細胞質中的壽命比其他RNA更長。最近，發現功能性circRNA被EV加載並轉移到受體細胞中。EV中的circRNA和線性RNA之間的比率高於生產細胞，表明內源性分選機制。由於它們增加的穩定性，circRNA可以被包裝到EV中並轉移到靶細胞，在那裏它們可以比典型的mRNA更長時間地支持蛋白質翻譯。值得注意的是，circRNA可以設計為具有內部核糖體進入位點(IRES)以表達感興趣的蛋白質。由於circRNA比線性RNA持續時間更長，這可能是產生增強的長期蛋白質表達的一種方法。這種應用在疫苗治療中特別有用，可以延長抗原對免疫系統的暴露時間，或者通常可以在治療劑量之外產生最多的蛋白質。雖然天然存在的具有ORF的circRNA在細胞中是少數，並且尚未被證明能夠翻譯，但已經嘗試設計具有編碼能力的circRNA。

將蛋白質包裝到EV中

雖然EXOtic系統允許將編碼蛋白質的mRNA包裝到EV中，但其他人已經開發出一種將未結合的治療性蛋白質加載到EV中的方法。CRY2是一種植物蛋白，在暴露於藍光時會改變構象，而CIBN是CIB1的截短版本，CIB1是一種對處於激發態的CRY2具有親和力的蛋白質。CIB1附着在EV標記CD9的胞質尾部，而CRY2附着在報告蛋白，例如mCherry和GFP。當生產細胞暴露在藍光下時，這個名為EXPLOR的系統被證明可以顺利获得與CIB1的可逆結合將cargo-CRY2加載到EV中。基於這個模型，Osteikoetxea等人測試了CRISPR相關核酸內切酶9(Cas9)蛋白是否可以加載到EV中，並將其與其他三種基於暴露於激活刺激物後的異二聚化的類似加載系統進行比較。研究證明，裝載CRY2-CIB1導致EV級分中的Cas9濃度最高，達到每個EV超過20個Cas9分子。這項研究的一個值得注意的觀察是數據表明，用於蛋白質貨物輸送的MysPalm工程似乎與工程化四跨膜蛋白標記（如CD9）相比更具優勢。這種觀察的兩個可能原因是：1)結合結構域在與膜蛋白結合時可能無法在ER中正確摺疊或2)它可能干擾CD9定位到EV膜中的天然位點。支持這一觀點的觀察結果表明，連在一起的Cas9活性僅為WTCas9的30-50%，表明這些加載系統降低了基因編輯的功效。這是相關的，因為未來治療性EV的功效將取決於數量遞送至靶細胞的活性治療性蛋白質。

另一種將蛋白質裝載到EV中的高度創新方法涉及使用WW標籤修飾貨物蛋白，該標籤可被Ndfip1識別，Ndfip1是一種含有L結構域的泛素連接酶，可泛素化貨物蛋白，在生物發生過程中將其引入EV41。與CRY2系統不同，附加到Cre的WW標籤在執行其功能時與WT蛋白一樣有效。WW-Cre在EV介導的遞送至受體細胞後發揮功能，並且WW-Cre以依賴於Ndfip1的方式加載到EV中。該方法巧妙地利用了細胞的內源性出芽和蛋白質加載系統，該系統可以擴展以加載治療性蛋白質進入EV。與CRY2-CIB1加載方法相比，該系統具有一些優勢。第一时间，WW結構域比CRY2蛋白小得多，與人類CRY2的593個殘基相比，僅測量了約40個殘基。可以說，較大的結合蛋白會帶來更高的干擾貨物蛋白功能的風險，從而限制治療效果。

最後，WW結構域天然存在於其他人類蛋白質中，因此與植物來源的CRY2-CIB1相比，可能會降低免疫反應的風險。這兩種系統都優於其他蛋白質加載系統，因為蛋白質在EV中是游離的，並直接遞送到靶細胞的細胞質中。

製造用於治療用途的EV

儘管有幾項正在進行的臨床試驗涉及EV，但到现在為止，還沒有EV療法進入市場。部分原因可能在於大規模製造EV的生產和純化工藝不足，而且大多數當前文獻的大部分重點是開發新的EV並顺利获得體外和動物研究證明它們的潛力，很少強調或理解轉化EV療法所需的條件。EV可以設計為攜帶治療分子，如蛋白質或RNA，許多研究正在進行以優化其治療潛力，方法是增加EV的產生和從生產細胞釋放，提高貨物裝載效率，增加組織趨向性，並增加貨物釋放到目標細胞。EV的生物發生由幾種ESCRT蛋白和參與囊泡形成和出芽的蛋白協調，因此，沉默或促進這些蛋白的表達可能會增加生產細胞釋放的EV的數量。這可能與提高生產細胞生產EV的效率和降低治療性EV的製造成本有關。研究人員開發了針對CHMP4C、VPS4B、ALIX和VTA1的shRNA，這四種ESCRT基因參與了EV生物發生。有趣的是，VPS4B和CHMP4C-shRNA、LIX和VTA1 shRNA的組合使釋放的EV數量增加了50%以上。

EV療法的挑戰和未來前景

大多數涉及EV的文獻都報告了顺利获得100,000g超速離心和顺利获得0.22um過濾器過濾從細胞上清液中提取EV。然後將這些分離的EV用於各種研究，包括體內評估。然而，這種方法很繁瑣，會產生異源的EV群體，並且可能難以在臨床上轉化。此外，體內不到48小時的相對較短的½壽命表明需要多次EV給藥作為治療策略。另一種方法是直接在體內設計細胞，以生產具有明確治療有效載荷的EV。人們可以設想或許使用隱形慢病毒載體系統或腺病毒在體內轉導細胞並將它們轉化為治療性EV生產工廠。或者，可以採用免疫細胞的離體轉導，將它們轉化為EV生產工廠，類似於现在對嵌合抗原T細胞(CAR)療法所做的工作。雖然安全性將是一個問題，但這種方法可以迴避這個問題困擾當前體外EV系統的製造和批次變化問題。為體內工程細胞增加安全，因為可以顺利获得使用組織特異性啟動子、選擇疾病特異性治療性RNA或靶向參與調節特定感興趣基因的長鏈非編碼RNA來設計EV工廠，這些基因僅針對疾病基因和不是宿主基因。安全性也可以顺利获得使用自殺基因來增強，例如西妥昔單抗(Erbitux)，它可以識別並特異性地對表達截短EGFR的細胞進行細胞死亡，並且在臨床上常規用於CAR療法以治療癌症。最後，也許下一代療法，例如使用混合整合LNP方法或LNP/腺病毒方法，可能證明可用於將體內肝細胞轉化為治療性EV工廠。無論如何，有一個事實很清楚，EV正在成為一種獨特的運載工具，它與LNP和基於載體的系統有很大不同，這無疑將改變基因和細胞治療的當前軌跡，並為治療各種疾病開闢光明的未來。問題不是是否，而是何時。

內源性和工程化EV途徑

參考文獻：

Cecchin R, Troyer Z, Witwer K, Morris KV. Extracellular vesicles: the next generation in gene therapy delivery. Mol Ther. 2023 Jan 24:S1525-0016(23)00021-7. doi: 10.1016/j.ymthe.2023.01.021. Epub ahead of print. PMID: 36698310.

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