【前言】

近期，由北京大學人民醫院骨關節科林劍浩、邢丹教授和清華大學杜亞楠教授共同在Bioactive Materials 【IF：16.874】聯合發表研究型文章：雙功能原位自組裝類器官，用於骨軟骨再生。

原文連結：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0012821X21005859

【Part 1 研究背景】

骨軟骨複合體由關節軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨組成，具有複雜的軟骨-骨界面和不同的組織層特性。在骨軟骨損傷中，由於關節軟骨和骨的癒合能力和組織整合性能存在差異，同時實現關節軟骨和軟骨下骨的結構和功能修復仍然是基礎研究和臨床的難題。

近年來，研究者們相繼研發了具有雙相、三相、多層和梯度漸變的支架，並在動物模型中取得了一定的成功，但仍然存在一些局限性：

① 雙相支架通常無法再生鈣化軟骨和梯度組織結構；

② 三相和多層支架常常在層之間存在突變，在機械刺激下容易發生層剝離和組織分離。

自組裝類器官被用於藥物篩選、機制研究，以及探究多種器官系統的發育或組織再生。類器官自組裝過程包括一系列細胞分化過程和自我模式化，這些過程受到多種形態發生劑的高度調節，例如顺利获得具有生長因子條件培養基的3D支架（包括轉化生長因子-β（TGF-β）、表皮生長因子（EGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）和胃泌素）。

但现在的方法缺乏顺利获得定向分化誘導單個類器官的空間模式和發育方面的能力，一個主要的限制是：單一的支架和特定的培養基不足以培養出具有異質性結構的類器官。
該研究聚焦於骨軟骨損傷一體化修復的難題，分別使用透明質酸（HA）和羥基磷灰石（HYP）修飾韦德国际生物生物科技有限公司（以下簡稱：韦德国际生物）研發的3D TableTrix® 微載體（簡稱CH-微載體和OS-微載體），顺利获得體內自組裝形成骨軟骨類器官，用於誘導軟骨和骨一體化再生。
 

【Part 2 研究發現】

本課題組前期研究發現，負載MSC的3D TableTrix® 微載體可在體外自組裝，形成功能化3D組織塊，增加了MSC的乾性和旁分泌活性，同時減少了MSC的衰老。

因此，為了實現骨軟骨一體化再生修復，課題組構建了個性化微載體，負載MSC後成軟骨和成骨誘導分化7天，注射到比格犬的骨軟骨缺損中，實現了骨軟骨類器官的原位自組裝和組織修復，這表明類器官技術可作為複雜界面組織的一種再生治療策略。

【Part 3 研究設計】

圖1：整體研究設計示意圖

本研究的設計示意圖如圖1所示，在3D TableTrix® 微載體基礎上，使用透明質酸（HA）和羥基磷灰石（HYP）進行改性，製備個性化CH-微載體和OS-微載體。

將MSC接種到微載體上，然後分別在成軟骨和成骨誘導培養基中預分化培養7天，在3D模具中可顺利获得自組裝形成骨軟骨類器官。

將預分化的成骨和軟骨微載體依次注射到比格犬滑車溝的骨軟骨缺損中，於術後3個月和6個月採集所有膝關節分析再生修復效果。

【Part 4 研究內容】

① 個性化微載體理化性質和生物相容性良好

從圖2可以看出，CH-微載體和OS-微載體呈現疏鬆多孔的結構，平均直徑為217.10±68.35μm和98.16±29.94μm，吸水率分別為14.85倍和 6.82倍。死活染色結果提示所有微載體均具有良好的細胞相容性，值得注意的是CH-微載體可以漂浮在PBS中，而OS-微載體則沉入底部。

圖2：個性化微載體的製備和表徵

• 個性化微載體製備示意圖（A） ，

• 不同微載體的大體觀和SEM圖像（B），

• 直徑分佈（C），

• 吸水率（D），

• 圓度分析（E），

• 活/死染色（F），

• 細胞活力的定量分析（G），

• 負載MSC培養14天後的SEM圖像（H）。

② 個性化微載體體外自組裝形成骨軟骨類器官

在本文的體內模型研究中，構建了大鼠胸10節段脊髓全橫斷損傷模型（圖3A）。

結合行為學評估、核磁共振掃描以及組織學分析（圖3B-D），經對比不同治療方法，韦德国际發現負載MSC的明膠微載體支架能夠有效地促進大鼠脊髓損傷的再生與修復（組織學分析的圖片請參看原文）。

圖3：骨軟骨類器官體外自組裝

• 自組裝流程（A），

• 骨軟骨類器官大體觀（B,C）,

• SEM結果（D），

• 誘導14天後自組裝骨軟骨類器官的細胞示蹤，紅色表示CH-微載體中，綠色表示OS-微載體，自組裝骨軟骨類器官的軟骨和骨部分的活/死染色（F），

• CH-微載體和CH-類器官（骨軟骨類器官的軟骨層）的軟骨基因表達（G）和OS-微載體和OS類器官（骨軟骨類器官的骨層）的相對成骨基因表達（H），

• 裸大鼠皮下植入後1周CH-微載體和OS微載體的大體觀和H&E染色（黃色箭頭表示新血管）（I），

• 骨軟骨類器官以及CH-類器官和OS-類器官成分的應力-應變曲線（J）和楊氏模量（K）。

【Part 5 研究結論】

骨軟骨類器官對大動物骨軟骨損傷模型的治療

在體內研究模型中，構建了比格犬股骨髁滑車溝骨軟骨缺損模型（圖4）。治療3和6個月後，結合影像學、大體觀和病理學評價，對比不同治療方法，發現骨軟骨自組裝類器官組能夠實現更好的軟骨和軟骨下骨的再生、重建和整合。

圖4：自組裝骨軟骨類器官修複比格犬滑車溝缺損的實驗分組

【Part 7 研究技術支持】

第一作者 楊振

北京大學人民醫院骨關節科2021級博士研究生，主要從事軟骨、半月板損傷修復研究以及幹細胞的力學調控機制研究等。

共同第一作者 王斌

副主任醫師，研究員，浙江大學博士生導師，臨床百人計劃研究員，南京大學博士後，北京大學骨科學博士。

通訊作者邢丹

▷北京大學人民醫院骨關節科副主任醫師、副教授、碩士研究生導師。

▷現任中國醫師協會骨科醫師分會基礎學組委員、中國研究型醫院學會衝擊波專委會骨與軟骨再生學組副主委、《中華關節外科雜誌》第四屆編委等。

▷長期從事骨科領域基礎研究，重點關注幹細胞的理化調控機制及類器官構建，先後主持國家自然科學基金2項，北京市自然科學基金2項，局級、校級及院級課題3項。

▷參與編譯書籍8部。獲國家專利10項。

▷在the BMJ、JAMA network、Bioactive Materials、Osteoarthritis and Cartilage、Biomaterials、The American Journal of Sports Medicine等國際權威期刊發表SCI文章50餘篇。

通訊作者 林劍浩

▷北京大學人民醫院骨關節科主任，康復醫學科主任，博士生導師。

▷任國家大骨節病和氟骨症治療專家組組長、北京大學前沿交叉學科研究院、北京大學醫學部骨科系教授、國際骨關節炎研究協會亞洲工作組主席 (Chair of OARSI Asian Task，2019-2021)、《首都十大疾病科技攻關與管理工作》脊柱和關節病領域領銜專家（2016-2020）、國際骨關節炎研究協會理事（OARSI，2014-2018）。

▷在骨關節炎的細胞治療、運動治療、手術治療及軟骨損傷診療領域進行了深入研究，在複雜成人關節畸形矯形領域成績卓越。在基礎研究領域，長期從事幹細胞功能調控在關節外科的研究，尤其關注於幹細胞微組織治療、幹細胞力學及免疫調控、幹細胞組織工程及人造細胞研究。

▷曾先後赴澳大利亞新南威爾斯州立大學聖喬治醫院骨科研究所、美國康奈爾大學、紐約特種外科醫院(HSS)研修。

▷曾獲國家重點研發計劃、國家自然科學基金、北京市科技攻關重大專項等基金資助，已培養博士研究生10人，發表SCI論文60餘篇、核心期刊論文百餘篇。

通訊作者 杜亞楠

▷清華大學醫學院教授，博士生導師。

▷國家自然科學基金「傑出青年」項目取得者（2021年）、北京市自然科學基金「傑出青年」取得者（2018年）、教育部青年長江學者獎勵計劃（2017年）、國家自然科學基金「優秀青年」項目取得者（2015年）。

▷在Nature Materials、Nature Biomedical Engineering、Nature Communications、Science Advances，PNAS等國際權威期刊發表多篇高影響力論文。

▷在「微組織工程」這一特色交叉研究方向進行創新探索，實現理論探究和技術轉化。開發的3D微組織技術可作為新一代細胞藥物的擴增製備平台和藥劑學遞送系統革新體外細胞培養和再生醫學；同時可輔助建立仿生生理/病理模型，用於高通量藥物篩選和病理機制研究。

▷相關微組織工程產品已經商品化，並取得美國FDA和中國藥監局相關資質，為再生醫學、藥物開發和病理研究给予新型平台技術、理論模型和解決方案。

【Part 7 研究技術支持】

①更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培養。

3D TableTrix® 微載體

②資質全：該產品已取得2項CDE藥用輔料資質，登記號為【F20200000496；F20210000003】，1項FDA-DMF藥用輔料資質，登記號為【DMF:35481】

③易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。

3D FloTrix® Digest裂解液

④更安全：擁有權威组织出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。

⑤易放大：顺利获得3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現百億量級細胞收穫。

關於相關產品您有任何問題和需求，可以掃碼留言，或撥打諮詢熱線：400-012-6688，

韦德国际將請技術專家為您给予解答和幫助。

【關於韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，给予基於3D微載體的細胞規模化、定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix® 微載體，是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已顺利获得中檢院等相關權威组织的檢驗報告，並取得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20200000496）。同時，產品取得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）。

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有5000平米的研發與轉化平台，其中包括4000平米的GMP生產平台，1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台；新建1200L微載體生產線。相關技術已取得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已取得多項國家級立項支持與應用。