Adv Sci丨基於CRISPR/ Cas13a的腫瘤源性細胞外囊泡microRNA檢測

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分類：新聞
作者：韦德国际生物
來源：韦德国际生物
發佈時間：2023-08-18
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以下文章來源於外泌體之家（公眾號）

細胞外囊泡（EVs）中的MicroRNAs（miRNAs）在癌症的發生和开展中起着至關重要的作用。EV miRNA的定量測量對於癌症診斷和縱向監測至關重要。然而，傳統的基於PCR的方法需要多步驟的程序。來自美國麻省總醫院的研究團隊介紹了一種利用CRISPR/Cas13a傳感系統的無擴增和無提取的EV miRNA檢測方法。CRISPR/Cas13a傳感組分被包裹在脂質體中，顺利获得脂質體-EV融合將其遞送到EV中，在卵巢癌細胞和患者血漿分析中顯著完成了miR-21-5p陽性的EV的計數。該EV miRNA傳感系統给予了無需RNA提取的完整EV特異性miRNA檢測方法，為蛋白質和RNA標記的多重/單個EV分析開闢了可能性。相關內容以「CRISPR/Cas13a-Based MicroRNA Detection in Tumor-Derived Extracellular Vesicles」為題於今年6月20日在線發表在國際知名綜合性、跨學科學術期刊Advanced Science雜誌上。

細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）是一種納米級的分泌顆粒，起源於細胞內體運輸系統。EV含有分子貨物，包括普通和細胞特異性蛋白質、核酸和脂質，反映了細胞起源的生理特徵。這一特性使得EV作為循環生物標誌物具有吸引力。在EV中包含的各種分子中，microRNAs （miRNAs）作為一組小的非編碼RNA，顺利获得抑制其靶RNA轉錄物的翻譯和切割靶RNA參與轉錄後基因調控。miRNA顺利获得EV介導的細胞間通訊參與許多生物過程，如細胞發育、細胞凋亡、細胞增殖、免疫反應和腫瘤發生。

很多研究已經證明了EV miRNA的不同作用。第一时间，miRNA參與疾病的發生和开展。因此，上調或下調的特異性miRNA可作為癌症、心血管疾病、肺病、神經退行性疾病等多種疾病的診斷標誌物。其次，EV miRNA在細胞間通訊中起着至關重要的作用。例如，從THP1細胞衍生的EV中釋放的淋巴細胞特異性miR-150被遞送到人微血管內皮HMEC-1細胞中，顺利获得調節c-Myb的表達來增強細胞遷移。因此，準確、定量地測量EV miRNA對於診斷性生物標誌物的臨床轉化、更好地理解EV藥物生物學過程至關重要。

EV miRNA的傳統檢測方法包括定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-qPCR）、northern blotting、微陣列和二代測序。雖然這些傳統方法比較敏感，並给予目標miRNA的相對定量，但都需要多個步驟，包括EV裂解、RNA提取、DNase處理、cDNA合成和擴增。考慮到EV在幾乎所有細胞中存在的不同EV亞型相關的高度異質性， EV裂解消除了單個EV中的細胞特異性信息，並顺利获得來自非靶EV亞群的miRNA來稀釋靶EV亞群中的miRNA。因此，在完整EV中檢測靶miRNA的能力可以顯著提高檢測精度，並為研究不同EV亞型的RNA生物標誌物鋪平了新的道路。

為分析決技術挑戰，研究團隊的目標是開發一種新的完整EV miRNA檢測技術。具體來說，研究團隊實現了成簇規律間隔短回文重複序列（CRISPR）-Cas系統，用於EV RNA檢測。CRISPR技術廣泛應用於基因組編輯、基因表達調控、生物傳感等領域。近年來，基於CRISPR的診斷技術被開發用於即時檢測SARS-CoV-2。在Cas核酸酶中，研究團隊選擇使用Cas13用CRISPR RNA （CrRNA）檢測EV靶miRNA分子。靶RNA與CrRNA的直接雜交可激活Cas13a的核糖核酸酶（RNase）活性。激活的Cas13a切割CrRNA結合的靶RNA（順式切割）和無邊界單鏈RNA分子（反式切割）。後者可用於生物傳感應用與熒光猝滅（fluorescence-quencher，FQ）探針連接單鏈RNA。這種方法避免了從RNA到cDNA的逆轉錄步驟，簡化了EV miRNA的檢測。

在這項研究中，研究人員報告了一種使用CRISPR/Cas13a的無擴增和無提取的EV miRNA檢測方法。研究人員在脂質體中加入了CRISPR傳感組分（包括Leptotrichia wadei菌來源的LwaCas13a、CrRNA和FQ探針），並顺利获得EV -脂質體融合將其傳遞給EV。與脂質聚合物納米顆粒、融合囊泡或脂質體的融合是在單個EV內遞送傳感材料的有效方法。這種策略给予了檢測目標miRNA的機會，而無需複雜的RNA提取或擴增。

經過體外驗證和檢測優化，研究人員將該傳感方法應用於檢測不同卵巢癌細胞系EV中的miR-21-5p。miR-21-5p在卵巢癌組織、細胞及其上皮細胞中被發現過表達。該檢測方法能夠量化含有miR-21-5p的EV數量。研究人員發現來自卵巢癌細胞系的2%-10%的EV顯示出miR-21-5p的陽性信號，明顯高於良性細胞的EV計數（<0.65%），這與使用金標準方法的批量分析具有良好的相關性。研究人員還發現，該方法可以與靶特異性EV在金磁盤陣列（gold disk arrays）上的免疫捕獲相結合，以測量EpCAM陽性的腫瘤來源EV的miR-21-5p，結果顯示卵巢癌患者血漿中的miR-21-5p陽性EV數量明顯高於健康對照組。這證明了在不提取RNA的情況下在完整EV中特異性檢測miRNA，以及對蛋白質和miRNA標記進行多重EV分析的可能性。

參考文獻：CRISPR/Cas13a-Based MicroRNA Detection in Tumor-Derived Extracellular Vesicles. Adv Sci (Weinh). 2023 Jun 20:e2301766.

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