為了治療嚴重威脅生命的疾病，幹細胞產品的開發和臨床轉化正在迅速开展。中國现在正在進行臨床研究的幹細胞產品包括來自人胚胎幹細胞（hESC）和人誘導多能幹細胞（hiPSC），以及能夠組織特異性分化的間充質幹細胞（MSCs）、胎兒幹細胞和成體幹細胞。

幹細胞產品的主要作用方式是用幹細胞衍生的功能細胞替換或修復各種疾病中受損的組織/細胞。MSCs是否屬於幹細胞，现在仍存在爭議。畢竟，MSCs的「乾性」高度依賴於組織來源。

與多能幹細胞相比，成體幹細胞的增殖和分化能力有限，但分化方向明確。

胎兒幹細胞比成人幹細胞具有更高的增殖能力，但胎兒組織來源有限，不穩定，涉及複雜的倫理問題，因此未得到廣泛應用。

從監管角度來看，美國食品和藥品監管局（FDA）尚未批准市場上的任何幹細胞產品，而FDA監管的幹細胞產品正在進行數百項臨床試驗。

自2009年以來，歐洲藥物管理局（EMA）批准了市場上的自體幹細胞治療產品，如軟骨細胞移植、Holoclar，並且沒有批准hPSC衍生的幹細胞產品。

2014年，日本完成了第一次自體hiPSC衍生視網膜色素上皮細胞移植以治療黃斑變性，並於2017年在日本衛生、勞動和福利部的監督下完成了第一次同種異體hiPSC細胞移植。

在中國，现在有兩種監管方法來監督幹細胞臨床研究。一種方法是使用「雙重歸檔系統」收集由國家醫藥產品管理局和國家衛生委員會共同管理的幹細胞研究醫療组织和醫生髮起的臨床研究項目的文件。另一種方法是，申辦方可以將研究新藥（IND）提交給國家醫藥產品管理局藥物評估中心（CDE），如果沒有提出異議，則在60個工作日審查後允許進行臨床試驗。在IND檔案中，可以给予先前由醫生髮起的臨床研究數據，以支持細胞產品的安全性和有效性。

CMC對幹細胞產品的研究主要集中在製造和質量控制方面。從製造業的角度看，幹細胞的分離、體外培養和誘導分化技術實現了向各種功能細胞的可控分化，處於特定分化階段的細胞（如早期前體細胞、成熟功能細胞等）是中間細胞產物。供體對供體的變化和幹細胞產品的批次對批次的變化使得很難確定合適的製造工藝和質量標準。大規模生產是一項挑戰。根據現有的科學知識和臨床經驗，來自不同來源的細胞差異很大，並且各種細胞類型的風險水平也不同。例如，hPSC衍生細胞產品的臨床應用的缺點是，由於其多分化潛能和四瘤形成能力，其理論致瘤風險顯著較高。

本文綜述了现在在中國的幹細胞產品規範中考慮的要點。使用生命周期管理策略說明了詳細考慮事項，包括原材料和輔料的管理、製造過程、質量研究和控制、穩定性、包裝和裝運（圖1）。

原材料、起始材料和輔料

應嚴格審核原材料，並制定內部規範。原材料應追溯至採購、製造、包裝、儲存和運輸全過程。對於直接接觸細胞的材料（比如細胞因子、化學分子、抗生素、磁珠或基質凝膠），首選醫藥級或臨床級材料。對於研究級試劑（包括培養基、肽、抗體、消化酶、血清），應清楚其組成，並建議進行全面測試以確保質量。ROCK抑制劑（如Y27632），通常在幹細胞消化過程中添加，以減少細胞死亡。鑒於在長時間傳代期間，添加ROCK抑制劑對細胞的影響尚不清楚，建議给予支持數據來解釋其使用的合理性。

避免使用動物源性材料，除非有正當理由，並且無需任何外來病毒污染的證明。應明確添加血清的必要性和劑量的合理性，並進行殘留血清檢測。鼓勵在幹細胞產品製造中使用無血清和化學定義的細胞培養用血清替代品。建議選擇合成消化酶替代動物源性材料。

▉飼養層細胞

許多幹細胞傳統上是在失活的飼養層細胞上培養的（如經輻照的小鼠胚胎成纖維細胞/人成纖維細胞）。隨着2D和3D培養的普及，现在已使用細胞外基質（如Matrigel、Geltrex和Vitronectin等）建立了無飼養層培養系統。建議使用化學定義的基質，以防止動物源性材料的偶然污染。例如，Matrigel來源於小鼠腫瘤細胞，如果使用，則需要對小鼠病毒進行全面測試，並對致瘤性進行風險評估。如果使用饋電單元，應建立單元組並進行徹底測試。應研究和驗證輻照劑量和其他細胞失活過程，以保持飼養層細胞的批間質量一致性。

起始材料指用於製造幹細胞產品的供體組織/細胞。根據現有的監管指南，捐贈者篩查應包括對各種病理學和遺傳病的檢測。對於以hPSC為起始原料的產品，應给予hPSC生產線的來源和建立文件，應根據GMP建立hPSC細胞庫，應明確規定細胞代次或細胞倍增時間，應參照國際標準對細胞庫進行全面測試。應進行細胞系穩定性研究，包括細胞培養性能和遺傳分析，以支持細胞系的一致性超過建議的累積群體加倍限制。

細胞產品通常含有冷凍保存劑（包括PBS、DMSO、HSA等），建議在配方中加入藥用輔料。

針對IND階段，必要時需要對未廣泛使用的賦形劑進行毒性研究和評估。針對NDA階段，輔料需要註冊，技術審查將根據2020年7月生效的最新中國藥品註冊法規並行進行。某些幹細胞產品涉及遞送裝置，包括避免免疫攻擊的封裝技術，或支持體內細胞生長的支架。在中國，幹細胞產品的設備部分將由NMPA醫療設備評估中心（CMDE）共同審查。

3.製造工藝

用於人體臨床試驗的細胞產品必須按照GMP生產。通常，幹細胞產品的製造過程包括供體細胞分離、細胞擴增、細胞庫建立、細胞分化、純化、配方、冷凍保存、儲存和輸送。應徹底研究工藝開發和優化、關鍵步驟和中間體的控制、雜質的去除。工藝流程和參數的基本原理將在IND應用期間進行技術審查。

4.過程開發

在開發的早期階段，通常採用實驗室規模的製造工藝，例如使用小型培養皿/燒瓶生產數量有限的細胞。在這種情況下，很難確保此類製造過程的再現性、無菌操作的控制、產品質量維護。對於臨床批量生產，建議優化工藝，調整規模，保持批間質量一致性，以滿足臨床試驗需要。大型細胞培養設備通常包括平底多層培養瓶（細胞工廠）、灌注生物反應器、攪拌生物反應器等[5]。多層細胞工廠可生產高達1010-1012個細胞，有限培養面積的灌注式生物反應器可生產約108個細胞。建議根據所需劑量、培養方法（單層培養、懸浮培養或2D、3D培養）、培養基變化頻率以及是否需要實時pH或O2監測來選擇用於臨床批量生產的細胞培養設備。

在培養臨床級hPSCs的過程中，細胞克隆的選擇和分化細胞的去除至關重要。嵌合克隆和異常增殖克隆應在傳代前鑑定並去除，否則細胞培養系統中可能會出現大量異常增殖細胞。在傳代操作方面，克隆機械分離、化學/酶消化等可應用於hPSC。消化後的細胞塊大小、傳代率、機械力強度、消化酶濃度和離心力以及培養基變化、細胞因子、pH、CO2濃度、細胞密度都是可能的關鍵工藝參數。細胞密度、克隆形狀、邊緣平滑度可能是監測hPSC未分化狀態的關鍵指標。重要的是，應仔細研究和限制hPSC的通道數。hPSC細胞在長期培養（例如幾個月）中容易積累基因突變，具有特定突變的細胞的快速生長可能導致克隆異質性，甚至形成顯性克隆[6]。因此，一般建議在hPSC細胞擴增過程中縮短時間，限制傳代次數，並在細胞狀態穩定時及時凍結hPSC細胞庫。

許多MSC都是大規模生產的。同樣，限制骨髓間充質幹細胞的傳代數量也是至關重要的。隨着傳代次數或培養時間的增加，建議分析MSC形態、增殖特徵、染色體、致瘤性和癌基因突變的發生情況，以明確體外細胞擴增的時間和傳代限制。值得注意的是，MSC的長期培養可能有細胞惡性轉化的風險。例如，研究表明，骨髓來源的骨髓間充質幹細胞體外培養106周後，其形態、增殖率、表型和分化能力發生了顯著變化，抑癌基因p16和p21啟動子區域的甲基化增加，細胞移植到免疫缺陷小鼠體內後可形成腫瘤樣組織[7]。由於高代細胞更容易發生惡性轉化，建議縮短培養時間，持續監測細胞倍增時間和遺傳表型。

重要的是，IND檔案中需要臨床/毒性批次的製造程序和標準操作規程以及詳細參數。隨着臨床試驗的進行，可以進一步深入研究過程和過程驗證的穩健性。

5.過程控制

大多數開放式製造系統和半封閉式系統都需要適當的過程中生物負載控制，以避免污染或交叉污染。如有必要，還應監測細胞的遺傳穩定性、特異性不定病毒或其他細胞類型的可能污染。與幹細胞相關的重編程和分化過程通常包括許多分化階段、遺傳操作、頻繁的培養基置換操作和長期培養時間。精確控制生產過程中不同階段（生殖層階段、前體細胞階段、中間分化階段和終末分化階段）的細胞命運是一項重大挑戰。人類使用的最終幹細胞產品主要由前體細胞或終末分化細胞組成。在某些情況下，需要防止這些細胞在培養系統中進一步分化/轉分化。因此，建議在適當的時間點控制每個階段細胞的分化潛能和標記物表達。例如，建議在細胞分離後對細胞特性和生存能力進行表徵，收穫前可在細胞上檢測細胞標記物、雜質（殘留抗生素和細胞因子等）、分化能力或細胞因子分泌活性等指標，以確保細胞質量符合要求。此外，應仔細評估供體細胞庫和細胞收穫的致瘤性風險。

6.配方工藝

應根據預期給藥途徑明確說明每種賦形劑的基本原理，並評估賦形劑與細胞之間的相容性。如果主辦方提及上市細胞產品的配方，則需要顺利获得穩定性數據評估和支持配方的適用性。在早期的小規模配方工藝開發中，經常使用手動填充工藝。生產設備、人員操作、冷凍保存和轉移管理應設計良好，以確保臨床批次不受任何污染。人工灌裝時應注意保證細胞含量的一致性和均勻性。應加強過程控制，確保無菌生產過程得到監控。在進行大規模生產時，鼓勵開發自動化灌裝工藝，以確保安全性和質量一致性。

7.質量研究和控制

幹細胞產品的質量表徵和控制涉及微生物安全性、特性、分子標記、效力、純度和雜質。

8.微生物安全

關於臨床受試者嚴重不良反應的大量報告表明，不良反應主要是由於幹細胞產品的微生物污染，包括細菌、真菌、支原體和細菌內毒素的污染。幹細胞給藥前的微生物檢測是確保患者安全的重要控制方法。如今，廣泛使用的BacT/Alert 3D自動培養系統等快速無菌檢測方法縮短了培養時間，並且在檢測能力方面與藥典方法沒有顯著差異[8]。支原體快速檢測方法包括核酸擴增技術和支原體代謝酶活性檢測。在中國，如果替代方法未得到充分驗證，建議同時使用無菌和支原體檢測的藥典方法進行釋放檢測。當釋放試驗僅使用快速釋放方法時，需要根據藥典驗證分析適用性和性能，以證明快速釋放方法可以取代藥典方法。對於可能含有殘留抗生素的產品，應在驗證中評估抗生素對無菌檢測的抑制作用。

9.身份和分子標記

幹細胞的身份可以顺利获得細胞形態學觀察、幹細胞標記物檢測、STR、體外分化潛能分析、畸胎瘤形成實驗等來檢測。使用STR驗證細胞來源時，建議在儘可能多的STR位點比較受試細胞和原始細胞（或衍生細胞）的基因分型結果。

從學術角度來看，隨着科学生命的开展，許多類型的幹細胞沒有得到徹底的表徵，新的標記物不斷被發現。幹細胞標記物的表達受多種因素影響，如供體變異、標記物在細胞內的分佈、分離和培養操作、培養基組成、細胞分化階段和不同的衰老水平。例如，在顺利获得不同重編程方法產生的hiPSC細胞中觀察到不同的幹細胞標記物表達水平和分化潛能[9]。當細胞暴露於特定生長因子或缺氧等培養條件下時，幹細胞標記物發生變化[10]。因此，文獻中報告的特定類型細胞的標記物可能不會出現在生產細胞批次上。建議贊助商研究臨床批次的分子標記物，並選擇能夠識別功能細胞類型的主要代表性標記物。對於分子標記物的分析，通常使用流式細胞術、免疫熒光法。試驗方法應表明標記物在細胞中的分佈，應採用細胞培養和試驗的標準操作方案、抗體的來源和類型以及適當的陰性和陽性對照。

10.致瘤性分析

幹細胞產品的致瘤性是阻礙其臨床轉化的主要因素。多種途徑可導致腫瘤形成。一方面，幹細胞增殖分化過程中的惡性轉化可能導致腫瘤的形成；另一方面，最終產物中殘留的未分化幹細胞可能形成畸胎瘤，尤其是hPSC衍生的細胞產物。

致瘤性檢測方法包括畸胎瘤形成分析、軟瓊脂分析、核型分析（G顯帶）或熒光原位雜交（FISH）等。建議在細胞培養階段、細胞庫試驗和釋放試驗中使用正交法檢測細胞的致瘤性。對於染色體分析，分析細胞的數量對分析的靈敏度至關重要。根據中國藥典，至少50個中期細胞應進行核型顯微鏡分析，大約500個中期細胞應用於檢查多倍體的發生率。

根據1700個hiPSC和hESC細胞的核型分析數據，一些核型異常的hiPSC和hESC細胞系可能具有相似的染色體變異特徵，如12號染色體重複[9]。對於hPSC產品，建議進行全面的遺傳分析，包括染色體拷貝數變異分析（CNV）、FISH、外顯子測序、單核苷酸多態性陣列或單細胞測序技術等，以檢測遺傳變異。對於惡性轉化問題，建議深入研究生產工藝和產品質量控制，持續監測細胞染色體穩定性。

现在，據報道，去除hPSC的方法包括添加小分子抑制劑以特異性誘導hPSC死亡/凋亡[11]，或使用苛刻的培養條件（如缺氧、低葡萄糖等）去除幹細胞並富集終末分化細胞[12]。對於hiPSC衍生產品，在hiPSC重編程過程中使用安全開關，例如自殺基因與轉錄因子基因的融合，也是避免轉錄因子持續表達從而降低腫瘤發生風險的可能解決方案。然而，安全開關的引入也增加了外源基因整合的風險，使用時有必要仔細評估風險效益比[13]。建議幹細胞產品規範包括使用流式細胞術分析、免疫組織化學或多潛能標記物（Myc、OCT4、SSEA4、Nanog等）定量聚合酶鏈反應分析檢測hPSC衍生產品中的殘留幹細胞。對於體外多次傳代的細胞，有限代內的低代、中代和高代細胞均需進行致瘤性和殘留hPSC分析，以降低腫瘤形成的風險。

11.純度和雜質

幹細胞產品中的雜質包括產品相關雜質和工藝相關雜質，影響產品的安全性和有效性，如殘留的高風險材料和非靶細胞。最終細胞產品中的非靶細胞通常包括飼養細胞、成纖維細胞、死亡細胞、殘留的種子幹細胞和未知細胞。如果無法準確檢測每種細胞類型的含量，則應確定細胞的表型，並根據最大劑量進行安全性評估。由於有限的製造經驗、來源、製備工藝、給藥途徑的變化以及不同的臨床需求，批量分析數據可用於設定IND階段非靶細胞百分比的驗收標準。對於與工藝相關的雜質，包括培養基成分、生長因子、消化酶、殘留珠粒等，建議累積多個收穫後批次的測試結果，或根據工藝參數（洗滌循環次數或稀釋次數）計算理論殘留量。在應用IND之前，應進行雜質檢測方法的初步驗證。

12.效力

效價測定是為了理想地反映細胞產物的作用機制（MOA），通常包括細胞替代治療的體外分化潛能測定、功能蛋白表達測定、細胞因子分泌測定和生理活性測定。一些產品打算用功能性細胞替代受損細胞或組織發揮作用，而另一些產品可能顺利获得分泌活性因子來實現體內功能。因此，效力的研究需要個案評估。替代相對效價試驗也可用於MOA未知的產品。

在臨床前階段，雖然標準參考可能不可用，但建議建立具有可接受變化的初級效價測定。相關技術方法包括免疫熒光染色、形態學觀察、流式細胞術分析、電生理分析等。應設置陽性和陰性對照，並仔細設計效價檢測前的細胞處理操作。對於心肌細胞和神經細胞，電生理活性試驗適用於測量細胞產物的功效，但很難定量表徵細胞功能。動物模型也可用於測量細胞產品的修復/再生能力，以評估體內的生物活性。對於MSC細胞的免疫調節功能，科學界提出可以結合不同的方法（如核糖核酸定量分析、標記物檢測、分泌蛋白分析和免疫細胞反應分析等）來表徵MSC細胞的免疫功能[14]。此外，MSC的分泌含量是反映其旁分泌作用的常見指標。

13.規格

製造過程的所有階段都伴隨着適當的過程中控制[15]。關於多能幹細胞庫的質量標準，可以從銀行组织找到相關標準，包括中國國家幹細胞資源庫[16]、國際幹細胞研究學會（ISSCR）和國際幹細胞庫倡議（ISCBI）[17]。對於生產過程中中間產品的質量控制，建議在不同時間點檢測安全項目（如無菌、支原體和內毒素）。此外，建議密切監測細胞分化潛能和遺傳穩定性。就最終產品的規格而言，建議包括外觀、無菌、支原體、內毒素、外來劑、特性、致瘤性、細胞數量、細胞活力、純度、效力、雜質殘留量、非靶細胞等測試項目。然而，在早期臨床試驗期間，有限的批次數量和少量的患者使得設置適當的規格具有挑戰性，並且在以後的開發過程中可以進行更多的細化。

14.穩定性、包裝和裝運

幹細胞產品的穩定性研究應涵蓋所有製造階段，包括供體組織採集、組織保存、組織/細胞運輸、細胞庫保存、中間細胞樣品、冷凍保存和最終產品的使用穩定性。建議使用具有代表性的細胞治療產品樣品進行穩定性研究，這些產品具有與臨床批次相似的液體體積和細胞密度範圍（如有）。產品的運輸穩定性研究主要集中在從細胞收集地點到生產地點再到臨床使用地點的運輸過程。應给予穩定性數據，以支持IND檔案中的運輸條件和時間。

袋、管廣泛用於包裝幹細胞產品，有時根據不同的給藥途徑涉及支架和設備。為了避免免疫反應，封裝也被用來包裝細胞產品。申請臨床試驗時，建議给予容器封閉系統的基本信息，如來源、質量規範和生物安全數據。為確保臨床使用的安全性，接受產品與由相同材料製成的小型容器/包裝系統之間兼容性的初步評估。應特別注意輔料（如二甲基亞碸）與容器之間的相容性。如果容器封閉系統廣泛用於包裝電池產品，初步穩定性研究結果可用於評估包裝材料的相容性。在申請市場授權之前，應根據相關指南，根據成分、細胞配方、保存條件和設備完成完整的兼容性研究。

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MSCs 藥物开展概況

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適用於 MSCs 產品的法規和指南

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化學、製造和控制（CMC）

幹細胞產品的原材料多種多樣，製造工藝複雜，質量控制方法千差萬別。在人類使用幹細胞產品之前，需要不斷努力提高幹細胞產品的安全性/有效性。现在，對供人類使用的幹細胞產品進行長期風險評估的經驗有限。在增加幹細胞產品進入臨床試驗之前，安全性評估至關重要。儘管hESC和hiPSC在理論上有可能產生各種類型的成體細胞，但由於培養基更換方案複雜、操作程序複雜、培養時間長，在控制分化過程中遇到了許多問題。類器官、三維培養技術、氣液界面培養、器官晶片和其他新的細胞/組織產品和技術也對製造過程的標準化提出了挑戰。幹細胞產品的CMC評價需要全面考慮在獲取供體細胞或組織、生產過程、儲存和運輸、臨床交付操作中引入的風險，以確保產品的有效生命周期管理。

對於使用病毒載體和其他基因轉導系統進行基因工程以進行重編程和基因修飾/重塑的幹細胞產品，應注意安全風險，如複製能力強的病毒、插入突變和癌基因激活。對於靜脈注射產品，肺部細胞的積聚和全身異位組織的形成是潛在的問題。

此外，现在還沒有關於如何選擇致瘤/致癌研究的動物模型的科學共識，因為合適的模型應該確保細胞能夠在體內長期存活，以研究是否可能發生潛在的腫瘤形成。應考慮生理學、解剖學、與人類的可比性、對人類細胞產物的免疫耐受性、給藥途徑的可行性、免疫缺陷動物的適用性、患病動物等因素來論證模型的合理性。值得注意的是，在動物給藥之前，細胞產品可能會經歷一系列操作，如清洗、傳代和培養基更換。因此，動物實驗用供試品應作為臨床批次同等對待。

中國最早的幹細胞產品法規可追溯到1993年，當時中國衛生部發佈了《臨床研究用細胞和基因治療產品質量控制指南》。2003年，中國食品藥品監督管理局發佈了《人體細胞治療研究與質量控制指南》[18]。2015年，中國衛生和計劃生育部與中國食品藥品監督管理局聯合發佈了《幹細胞臨床研究管理指南》，並「幹細胞醫藥產品和臨床前研究質量控制指南」，以規範幹細胞臨床研究和質量控制。2017年，中國食品藥品監督管理局發佈了「細胞治療產品研究和評價指南」「，提出了細胞藥物註冊和應用的技術要求。2019年，更新了《中華人民共和國藥品管理法》，強調了藥物的生命周期管理。建議建立一個強大的監測系統，以符合要求。2020年，但書更新了《藥品註冊條例》，規定市場授權持有人對藥品開發負有主要責任，相關文件將第一时间說明細胞產品的檔案要求。

隨着全球老齡化人口的增加和細胞治療的快速开展，臨床對再生藥物的需求日益增長。要成功地對再生醫療產品進行監管，需要有健全的原則。對於發起人，尤其是初創公司，鼓勵與監管组织進行早期互動，以大幅加快幹細胞產品的开展。儘管需要做出更多努力來解決CMC問題並繼續進行臨床探索，但相信隨着中國藥品審查制度的持續改革政策和幹細胞產品監管政策的逐步全球趨同[19]，以及細胞治療科學生物學研究和產業的進步，將開發越來越多的幹細胞產品，使數百萬醫療需求未得到滿足的患者受益。