以下文章來源於幹細胞者說(公眾號)
將細胞、組織或者器官冷凍在-80℃尤其是-140℃以下,並保證其存活能力的過程稱為細胞的冷凍保存。細胞低溫保存的隱患之一來自於低溫狀態下水結晶對細胞器和細胞膜的損傷。
根據避免細胞內外水結晶的原理,常用於人多能幹細胞凍存的方法包括玻璃化冷凍法和慢凍法兩種。
玻璃化冷凍法是一種快速冷卻方法,通過使用高濃度的冷凍保護劑誘導組織細胞轉變為玻璃樣凝固態,並在-196℃條件下快速冷卻的過程。在整個快速的冷卻和復溫過程中,細胞內外均無冰晶產生,有效避免了冷凍損傷,細胞活性得以保留。玻璃化冷凍法需要精確的時間控制,因此將其應用於臨床級細胞的保存具有挑戰性。
慢凍法是一種較經典的冷凍方法,通過使用低濃度的冷凍保護劑(如10% DMSO)以約 –1°C/min的速度冷凍細胞。在這種情況下,細胞外的水首先凍結,從而增加了細胞外空間的滲透壓,細胞內外空間之間的滲透間隙導致細胞脫水,因此可以減少細胞內冰晶的形成。
下文以CryoStor® CS10細胞凍存液為例演示如何通過慢凍法對人多能幹細胞進行冷凍保存。CryoStor® CS10是一種不含血清和動物成分的臨床級別的細胞凍存液,推薦用於人胚胎和誘導多能幹細胞等敏感細胞類型的冷凍保存。
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CryoStor® CS10(產品號 #07930)
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溫和的細胞解離試劑GCDR(產品號 #07174)
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mTeSR™ Plus(產品號 #100-0276)
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凍存管(產品號 #100-0091)
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15 mL離心管(產品號 #38009)
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2 mL無菌移液器吸頭
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細胞程序降溫盒
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-150℃冷凍櫃或液氮罐
開始之前:以下步驟是以在6孔板中通過mTeSR™ Plus培養的人ESC或iPSC為例。培養物應在準備傳代時收穫並冷凍保存。如使用其他規格培養皿,請相應調整體積。
1.在板底部標記培養細胞的分化區域。
2.通過移液器槍頭的尖端刮擦去除分化區域。
*避免將培養板從培養箱中取出一次超過15分鐘。
3.吸出剩餘的培養基。向每個孔中添加1 mL GCDR,並在室溫下孵育5-8分鐘。
4.吸出GCDR,並添加1 mL的mTeSR™ Plus。用血清移液管或細胞刮刀輕輕刮擦集落,並確保細胞聚集體體積不能過小。
5.使用2 mL血清移液管將聚集體轉移到15 mL離心管中。
6.在室溫下以300 xg離心5分鐘。輕輕吸出上清液,保持沉澱完整。
7.添加6 mL預冷的CryoStor® CS10到沉澱中。
*使用前用70%乙醇或異丙醇擦拭瓶子外部。
8.使用2 mL血清移液管移出沉澱,儘量避免造成細胞聚集體的破碎。
9.使用2 mL血清移液管輕輕將細胞懸浮液轉移至凍存管中。
10.使用以下其中一種方法冷凍保存細胞聚集體:
A.標準慢凍方案:以大約-1°C/min的速度進行程序降溫,然後在-135°C(液氮)或更低的溫度下長期儲存。不建議在-80°C長期儲存。
B.多步驟方案:細胞在-20°C下保存2小時,然後在-80°C下保存2小時,最後在-135°C(液氮)或更低的溫度下長期儲存。
【關於韦德国际生物】
北京韦德国际生物科技有限公司成立於2018年,由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建,清華大學參股共建。核心技術源於清華大學科技成果轉化,並憑藉此項技術榮登中國科協「科創中國」先導技術榜。作為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業、潛在獨角獸企業,更獲得國家科技部多項重點研發專項支持。
作為高質量三維細胞製造專家,韦德国际生物提供基於3D微載體的一站式定製化細胞規模化擴增整體解決方案,打造了原創3D細胞智造平台,實現規模化、自動化、智能化、密閉式的細胞藥物及其衍生品生產製備,以此幫助全球客戶建立最為先進的細胞藥物生產線。在開創【百億量級】幹細胞製備工藝管線後,加速向【千億量級】進發,致力於以3D細胞規模化智造技術賦能細胞與基因治療產業,惠及更多患者。
韦德国际生物的產品與服務,已廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時,在再生醫學、類器官與食品科技(細胞培養肉等)領域也具有廣泛應用前景。並且,目前已助力多家細胞與基因治療企業進行IND申報。
韦德国际生物擁有5000平米的研發與轉化平台,其中包括1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台;以及4000平米的GMP生產平台,並新建了1200L微載體生產線。此外還在上海設有2000餘平的國際合作與技術應用中心,以技術創新持續融入全球生物產業新業態。
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