【流感疫苗的發展】

流感是一種高度傳染性疾病，目前商業規模上使用最廣泛的疫苗類型為滅活流感疫苗和亞單位疫苗。流感疫苗由一種或多種病毒株組成，這些病毒株通常在胚胎母雞蛋的尿囊腔中產生。

但是由雞胚生產疫苗有許多缺點：

a. 病毒選擇性複製導致低免疫原性；

b. 勞動強度大、產量低，流感大爆發時難以滿足需求；

c. 抗原間存在差異；

d. 若流感起源於禽類，在雞蛋中獲得的疫苗可能對人體致命；

e. 卵源成分可能引起接種者發燒和致病[1]。

         圖1 病毒在雞蛋中選擇複製和MDCK細胞中的全部複製[2]

相細胞培養的流感病毒有很多優勢：

a. 高免疫原性；

b. 容易大規模生產，降低勞動強度，更快製備且產量高；

c. 封閉化生產，無細菌污染；

d. 標準化製備，具有更高初始純度；

e. 標準化流程，減少批次間差異；

f. 為雞蛋過敏的人提供了選擇。

【MDCK細胞應用疫苗情況】

MDCK 細胞與病毒親和性高、增殖速度快且不易發生突變，目前被認為是適合用於甲、乙型流感疫苗生產的細胞系之一。MDCK最初需要貼壁培養，但傳統二維平面培養不利於逐級放大，隨着微載體的發現和使用，這個問題逐漸得到解決。微載體可實現貼壁細胞懸浮培養，可有效增大一批次細胞培養量和病毒收穫量。

【3D TableTrix®微載體培養MDCK細胞工藝簡介】

對於貼壁MDCK，使用微載體/反應器工藝是目前大規模培養流感病毒傳播所需細胞的最佳選擇，因為它們具有高的比表面積，可使用生物反應器進行大規模培養，並且可以更好地監測和控制。

微載體懸浮培養技術可以在攪拌式生物反應器中進行。應用3D TableTrix®微載體（圖2）在3D FloTrix® miniSPIN 生物反應器（圖3）中可實現細胞育種，配合3D FloTrix® vivaSPIN 自動化生物反應器（圖4）可實現細胞量的逐級放大，完成細胞、病毒以及細胞產物的收穫。溫度、溶氧、pH、轉速、Air、O₂、CO2、N2 等細胞培養工藝參數可實現高精度、自動化控制，為細胞提供良好的環境，有助於細胞的增殖。通過設置自動換液程序（表1），為細胞生長提供充足的營養，並維持良好的生長環境，最終達到近1000萬/mL的細胞密度（圖5）。

與二維培養相比，大批量培養細胞時降低了在空間、人工、試劑耗材和時間上的成本，同時極大提高了細胞密度，目前基於3D TableTrix® 微載體的貼壁培養已達到與全懸浮培養相似的細胞密度[3]。而相較於懸浮細胞培養，貼壁培養避免了懸浮細胞致瘤的可能，並能在感染病毒時減少細胞損失，具有明顯的優勢。

          圖2 3D TableTrix®微載體          圖3 3D FloTrix® miniSPIN 生物反應器       圖4 3D FloTrix® vivaSPIN 自動化生物反應器  

表1 MDCK細胞微載體沉降換液及攪拌設計

                  圖5 MDCK細胞增殖曲線

【連續放大傳代工藝】 

微載體：3D TableTrix®微載體（V系列）

反應器：125mL 透氣內置葉輪培養瓶（SF125）

連續傳代思路：50萬/mL的細胞密度接種，3天內增殖5倍及以上，1：5進行傳代。

方法：用PBS原瓶清洗3次去除血清殘留，加入重組胰酶消化10-30min後細胞從載體上脫落（圖6），用完全培養基終止消化。對應量的細胞和微載體泵入下一級反應器進行放大培養（圖7）。

                       圖6 MDCK-D3重組胰酶原瓶消化30min

                   圖7 MDCK連續傳代增殖情況

【結論】

3D TableTrix®微載體（V系列）可實現MDCK細胞在生物反應器中懸浮培養，並進行傳代擴增，最高細胞密度達到1000萬/mL。總的來說，使用3D TableTrix®微載體（V系列）配合3D FloTrix® vivaSPIN 自動化生物反應器的獨特優勢，可在短時間內收穫期望的細胞量，這極大地滿足了科研及生產的需求，為疫苗企業帶來了新的動力。

參考文獻：

[1] FENG, S.-Z., JIAO, P.-R., QI, W.-B., et al. Development and strategies of cell-culture technology for influenza vaccine[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2011,89(4):893-902. DOI:10.1007/s00253-010-2973-9.

[2] GREGERSEN JP, SCHMITT HJ, TRUSHEIM H, et al. Safety of MDCK cell culture-based influenza vaccines.[J]. Future microbiology,2011,6(2):143-152. DOI:10.2217/fmb.10.161.

[3]趙彩紅,王美皓,李自良,靳冬武,馬花,馬忠仁,喬自林,陳宏,張家友,王家敏.無血清懸浮培養MDCK細胞系的建立及生物反應器高密度培養[J].中國生物製品學雜誌,2021,34(11):1362-1369.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.003482.

【韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，提供基於3D微載體的細胞規模化定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix®微載片（微載體），是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已通過中檢院等相關權威機構的檢驗報告，並獲得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20210000496）。同時，產品獲得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）。 

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有研發與轉化平台5000平米，其中包括CDMO平台1000餘平；GMP生產平台4000平米，新建1200L微載體生產線。相關技術已獲得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已獲得多項國家級立項支持與應用。