近日，由南京大學蔣青教授團隊和清華大學杜亞楠教授團隊，共同在Bioactive Materials（《生物活性材料》）雜誌【IF：14.593】發表了題為「A low dose cell therapy system for treating osteoarthritis: In vivo study and in vitro mechanistic investigations（一種治療骨關節炎的低劑量細胞療法：體內模型研究與體外模型機制探討）」的研究文章。

研究發現：採用由3D規模化培養工藝製備的承載有間充質幹細胞（MSC）的微載體（即MSC微組織）作為幹細胞治療的給藥平台，可以解決傳統游離幹細胞給藥治療骨關節炎所面臨的系列問題，有望減少治療應用所需的細胞劑量和注射頻率，並通過分泌組學和全轉錄組分析探究了MSC微組織應用於骨關節炎治療的潛在作用機理。

【研究背景】

骨關節炎（Osteoarthritis, OA）是一種非炎症性的退行性疾病，病理表現為關節軟骨退行性病變、繼發性骨質增生等特徵，在我國病發率高達15%以上，且近年逐漸呈現「年輕化」的趨勢，呈關節僵硬、腫大、疼痛、關節周圍肌萎縮等臨床症狀，嚴重影響患者的生活質量。

得益於間充質幹細胞（MSC）的自我更新、定向分化、免疫調節等方面的潛力與易獲取性，基於MSC的幹細胞治療正作為一種新興的再生醫學療法廣泛應用於骨關節炎的臨床前研究和臨床研究中，並初見成效；在2021年發表於《中國醫學前沿雜誌（電子版）》的《骨關節炎臨床藥物治療專家共識》一文中，MSC入列為骨關節炎治療的生物製劑類候選藥物。

但在傳統的給藥方式中，採用關節腔內注射游離MSC仍存在如細胞劑量、細胞流失、細胞存活、與宿主組織的整合等一系列問題，限制了其療效的穩定性，因此需要開發更有效的細胞製劑形式和遞送平台。從2014年起，清華大學醫學院杜亞楠教授團隊率先於國際上提出「幹細胞藥劑學」的概念，採用3D多孔微載體複合幹細胞進行製劑和給藥，在糖尿病及其併發症、骨關節炎、肝纖維化等領域取得了一系列研究進展。

【研究內容】

▲圖｜本研究的技術路線設計

1、體外3D培養形成MSC微組織

研究結果表明，應用韦德国际生物3D FloTrix® 微載體聯合攪拌式生物反應器能夠在體外培養中實現MSC微組織的形成。在一定培養周期內，微組織中的幹細胞保持高活率（綠色熒光標記活細胞，紅色熒光標記死細胞），乾性相關基因（Sox2、Oct4、Nanog）表達上調、衰老相關基因（P21、P16、P53）表達下調；相較於獨立注射的游離MSC，通過微組織形式給藥的MSC在小鼠體內可留存長達21天以上，存活效率更高。

2、MSC微組織對體內OA模型的治療

在本文的體內模型研究中，通過對大鼠實施前交叉韌帶 (ACL) 橫斷手術來構建體內OA模型（圖A）。結合Micro-CT（μ-CT）、放射性成像和組織學分析，經對比不同治療方法，單劑次注射1×10⁵起始細胞數的MSC微組織與4劑次注射1×10⁶游離MSC的治療效果相當（影像學分析與組織學分析的圖片請參看原文）。

【MDCK細胞應用疫苗情況】

MDCK 細胞與病毒親和性高、增殖速度快且不易發生突變，目前被認為是適合用於甲、乙型流感疫苗生產的細胞系之一。MDCK最初需要貼壁培養，但傳統二維平面培養不利於逐級放大，隨着微載體的發現和使用，這個問題逐漸得到解決。微載體可實現貼壁細胞懸浮培養，可有效增大一批次細胞培養量和病毒收穫量。

3、MSC微組織與軟骨細胞的互動機制探究

本研究從患有膝骨關節炎的供者獲取軟骨組織、分離原代軟骨細胞後，通過Transwell建立起體外OA模型，分別採用二維培養的MSC（2D培養組）或三維培養的MSC微組織（3D培養組）與原代軟骨細胞進行共培養（圖A）。與軟骨再生相關的COL2和SOX9在3D培養組的軟骨細胞中表達顯著上調，並通過Western Blot驗證COL2和SOX9在蛋白水平上也高表達（圖B），說明MSC微組織相比游離細胞給藥或許更能有效促進軟骨再生。

本研究在體外模型的基礎上進行了大量組學分析。對共培養上清液的分泌組學分析顯示，3D培養組中對軟骨修復起重要作用的GM-CSF分泌量高，並且IL-6R含量低（圖C），說明MSC微組織相比於游離細胞給藥可起到抑制炎症、促修復的效果。通過全轉錄組RNA測序對比不同組別中各種細胞的差異化表達基因（DEG），結合GO富集分析與KEGG pathway分析，發現在3D培養組中：MSC呈現出與早期軟骨誘導分化過程相似的基因表達，軟骨細胞呈現出更有利於維持關節軟骨相關表型的基因表達，並且細胞因子與受體互作的通路更為靈敏、MSC與軟骨細胞之間的旁分泌互作更為有效（更多分析細節請參看原文）。該結果進一步闡釋了MSC微組織相比於游離細胞給藥療效更顯著的潛在原因。

【研究結論】

本研究提出以3D規模化培養工藝製備的微組織作為幹細胞遞送平台，能夠減少MSC治療所需的細胞劑量和注射頻率即達到與傳統高劑量給藥方式相近的療效，並通過分泌組學與全轉錄組分析表明微組織給藥更有利於促進MSC與軟骨細胞之間的相互交流，通過自分化、抑炎性微環境調控和旁分泌效應促成軟骨再生。3D FloTrix® 微載體的應用技術有望加速MSC在骨關節炎中的應用進展。

【研究團隊】

● 本項研究由南京大學、清華大學以及北京韦德国际生物科技有限公司合作完成。

● 南京大學蔣青教授和清華大學醫學院杜亞楠教授為本論文通訊作者。

● 蔣青教授課題組王斌博士（現就職於浙江大學附屬第一醫院）和北京韦德国际生物科技有限公司總經理劉偉博士為本論文的共同第一作者。

南京大學醫學院-蔣青教授

主要從事骨科及運動醫學臨床和基礎研究，是國內運動醫學專業唯一的國家傑出青年基金獲得者。

任國際關節炎協會（OARSI）任職理事、SICOT中國分會基礎研究分會副主任委員、國際軟骨損傷修復學會（ICRS）中國分會副主委。

共發表中文核心論文200餘篇、SCI論文100餘篇（發表在Nature Medicine，Nature Genetic，ACS Nano等雜誌）2007有篇論文被評為中國最有影響的百篇國際論文，文章總引用數為825次，單篇最高他引為119次。

蔣青教授團隊獲得多項國家專利，其中包括三維打印技術專利2項，踝關節屈伸運動器專利1項，膝關節置換專利2項，修復關節軟骨損傷專利1項等

清華大學醫學院-杜亞楠教授

在「微組織工程」交叉研究方向進行創新探索，實現理論探究和技術轉化。

開發的3D微組織技術可作為新一代細胞藥物的擴增製備平台和藥劑學遞送系統，革新體外細胞培養和再生醫學；同時可輔助建立仿生生理/病理模型，用於高通量藥物篩選和病理機制研究。

共發表高影響力 SCI 論文 100 余篇 (發表在 Nature Materials，Nature Communications, PNAS，Science Advances 等雜誌)。

批准授權專利 16 項，相關微組織工程技術專利技術於 2018 年成立北京韦德国际生物科技有限公司進行轉化應用和商品化。

【研究應用材料及設備】

3D TableTrix®微載體（多孔明膠微載體）  3D FloTrix®vivaSPIN生物反應反應器（攪拌式）   3D FloTrix®miniSPIN生物反應器（攪拌式）

原文連結：

http://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.05.029

參考文獻：

《骨關節炎臨床藥物治療專家共識》：

http://www.yixueqianyan.cn/CN/abstract/abstract3673.shtml

【韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，提供基於3D微載體的細胞規模化定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix®微載片（微載體），是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已通過中檢院等相關權威機構的檢驗報告，並獲得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20210000496）。同時，產品獲得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）。 

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有研發與轉化平台5000平米，其中包括CDMO平台1000餘平；GMP生產平台4000平米，新建1200L微載體生產線。相關技術已獲得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已獲得多項國家級立項支持與應用。