【前言】

膝骨關節炎(Knee Osteoarthritis, KOA)是以關節軟骨退變，持續性炎症為主要症狀的關節疾病，全球患者超過6億人，半數患者有膝關節疼痛、腫脹，活動障礙等症狀，同時也是老年人致殘的主要原因，KOA的高發病率和高致殘率導致了嚴重的社會疾病負擔。目前臨床上主要是通過非甾體類抗炎藥(NSAIDs)或關節置換手術來緩解疾病症狀，這些方法面臨着持續的高個人成本和複雜的併發症等難題。近年來，學者們逐步將目光移至外泌體治療膝骨關節炎領域，外泌體作為細胞間通訊的信使，可以將miRNA等分子傳遞給受體細胞，實現調節細胞生長和代謝，甚至調節組織微環境的效能。

近日，由浙江大學醫學院附屬第一醫院王斌教授團隊在Chemical Engineering Journal（《化學工程》）雜誌【IF：15.1】發表了題為「Exosomes derived from 3D-cultured MSCs alleviate knee osteoarthritis by promoting M2 macrophage polarization through miR-365a-5p and inhibiting TLR2/Myd88/NF-κB pathway」（3D培養間充質幹細胞來源外泌體通過miR-365a-5p促進巨噬細胞M2極化和抑制TLR2/Myd88/NF-κB通路緩解膝骨關節炎）的文章。

       圖1. 細胞貼附在3D TableTrix® 微載體上進行三維培養

研究發現通過三維培養體系培養間充質幹細胞（Mesenchymal Stem Cell, MSC）和切向流過濾濃縮細胞上清（研發自北京韦德国际生物公司）收穫的3D間充質幹細胞外泌體（3D-EXO）相比傳統培養模式下獲得的間充質幹細胞外泌體（2D-EXO）具有更好的膝骨關節炎治療效果和單位MSC外泌體產量，可以有效改善傳統模式生產收穫的外泌體療效及產量有限的問題，並通過RNA測序分析了2D-EXO和3D-EXO的內容物差異，探究3D-EXO具有更強膝骨關節炎療效的深層機制。

原文連結：http://doi.org/10.1016/j.cej.2024.154432

【Part1 研究背景】

	膝骨關節炎具有疾病持續久，病人基數大等特性，但當前外泌體生產模式難以提供與之對應的外泌體效能及產量，限制了外泌體治療膝骨關節炎的臨床轉化，因此如何增效加量成為了外泌體生產流程的研究重點之一。   由清華大學科技成果轉換的外泌體生產體系，對當前外泌體生產難題進行了針對性改進，本研究是三維培養間充質幹細胞外泌體在膝骨關節炎治療中的首次運用。
圖2. 3D FloTrix® vivaEXO 外泌體收穫系統

【Part2 研究設計】

圖3. 整體研究設計示意圖

使用韦德国际生物3D微載體培養MSC，來生產3D-EXO，並與傳統2D培養MSC生產的2D-EXO進行比較。在ACLT誘導的KOA大鼠模型中評估3D-EXO和2D-EXO的治療效果。進一步地，通過成像技術、組織學分析和免疫熒光染色等方法評估關節結構和軟骨退行性變化。進行體內外實驗，研究3D-EXO和2D-EXO對軟骨細胞和巨噬細胞的影響。最後，探討了3D-EXO相比2D-EXO表現出更好的治療效果的潛在機制。

【Part2 研究內容】

三維培養體系提升單位MSC外泌體產量

圖4. 3D-EXO和2D-EXO的生產模式及其表徵

以傳統MSC培養模式作為對照，藉助韦德国际生物3D FloTrix® 微載體和3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反應器賦予MSC更貼合體內微環境的三維培養環境，在三維環境下培養的MSC充分貼合微凝膠，並保持了良好的細胞活性。與傳統模式培養的MSC相比，三維培養MSC來源外泌體在表面標誌和粒徑分佈充分符合外泌體理化性質定義的同時，獲得了更為可觀的單位MSC外泌體產量（圖4 A-F）。

3D-EXO和2D-EXO對大鼠膝骨關節炎模型的體內外實驗結果存在差異

圖5. 各組大鼠KOA模型的組織學和免疫熒光染色結果

在本文的體內實驗研究中，構建了大鼠前交叉韌帶橫斷（anterior cruciate ligament transection, ACLT）模型，結合組織學分析，軟骨細胞代謝marker免疫熒光及影像學分析，經對比不同治療方法，韦德国际發現外泌體對KOA模型鼠具有顯著治療效果，且3D的治療效果顯著優於2D-EXO（圖5 A-D）（影像學分析的圖片請參看原文）。

圖6. 3D-EXO和2D-EXO對體外軟骨細胞代謝的影響

與體內實驗3D-EXO相比2D-EXO具有顯著療效優勢截然不同，在體外試驗中，軟骨細胞能有效攝取3D-EXO和2D-EXO，且均能引起軟骨細胞代謝狀態的改善，但3D-EXO相比2D-EXO干預軟骨細胞並未使軟骨細胞的代謝狀態發生更理想的轉變（圖6 A-K），這指引韦德国际對3D-EXO治療軟骨細胞的間接機制進行探索。

圖7. 2D-EXO和3D-EXO在體內外實驗中對巨噬細胞極化的影響

巨噬細胞作為體內炎症反應的重要角色，其極化方向會調控炎症的發生髮展。研究者猜想3D-EXO比2D-EXO在體內實驗治療效果的優勢源於其對巨噬細胞極化方向調控能力的差異，體外實驗證明巨噬細胞可以攝取2D-EXO和3D-EXO，並證實了3D-EXO相比2D-EXO可以顯著影響巨噬細胞的M2極化（圖7 A-J）。

3D-EXO治療膝骨關節炎的機制探究

圖8. miR-365a-5p是3D-EXO中促進M2巨噬細胞極化的主要參與者

本研究收集了濃縮後的2D-EXO和3D-EXO進行RNA測序分析，並記錄了3D-EXO相比2D-EXO上調最明顯的五個miRNA，並通過RT-PCR對這五個miRNA干預巨噬細胞極化效果的驗證，並選定促進巨噬細胞M2極化效果最為顯著的miR-365a-5p進行後續驗證（圖8 A-D）。

圖9. 組織學與免疫組織化學評估

圖10. 3D-EXO通過促進巨噬細胞M2極化改善軟骨細胞代謝狀態

通過3D-EXO與miR-365a-5p inh拯救實驗，雙熒光素酶實驗及軟骨細胞和巨噬細胞共培養實驗證明miR-365a-5p是3D-EXO相比2D-EXO對膝骨關節炎治療效果優勢的主要作用成分，作用通路為TLR2/Myd88/NF-κB（圖9 A-M, 圖10 A-S）。

當涉及到選擇細胞時，研究結果表明，向MSC中添加低百分比的軟骨細胞可以促進表型穩定的軟骨分化，從而抵抗外源性誘導的MSCs可以抵抗外源性誘導的軟骨肥大分化，軟骨肥大分化後容易喪失原有的抗壓耐磨等生物學功能。目前，CORG的發展仍處於初級階段，雖然已經構建了各種CORGs，但其經常發生向肥大軟骨表型的分化。

【Part4 研究結論】

在這項研究中，研究人員通過在3D環境中培養MSCs來生產3D- EXO，3D-EXO具有上調的外泌體miR-365a-5p含量，從而有效抑制巨噬細胞中TLR2/Myd88/NF-κB信號通路的表達，促進巨噬細胞M2極化，最終M2巨噬細胞作用於軟骨細胞並改善其代謝狀態。這種細胞間相互作用在宏觀上導致在大鼠KOA模型里3D-EXO的治療效果比2D-EXO更顯著；研究結果為KOA的治療提供了新的靶點和治療途徑。

【Part5 研究應用材料及設備】

3D TableTrix® 微載體

① 更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培養。 ② 資質全：該產品已獲得2項CDE藥用輔料資質，登記號為【F20200000496；F20210000003】，3項FDA原料藥及藥用輔料資質，登記號為【DMF：037798、035481；MF：29721】 ③ 易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。 ④ 更安全：擁有權威機構出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。 ⑤ 易放大：通過3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現千億量級細胞收穫。 ⑥ 更優質：通過3D多孔可降解微載體+ 動態培養技術，進行三維培養，優勢顯著——培養細胞體積更小、遷徙能力更強，同時具備更卓越的免疫調節和組織修復潛能。

3D FloTrix® microSPIN  6通道微型生物反應器

① 超薄設計： 超薄主機高度僅48mm，扁平化設計可進一步提高培養箱空間利用率。 ② 不鏽鋼機身： 主機採用全不鏽鋼設計，易清潔好擦拭，滿足潔淨需求。 ③ 適配一次性反應瓶： 適配韦德国际自研透氣內置葉輪一次性反應瓶。其中，搭配125/250ml透氣內置葉輪一次性反應瓶，可在一台170L培養箱放置2台設備，實現共8個瓶位的培養體系。 ④ 同步關聯： 開啟關聯功能，並結合配方工藝的使用，可將多個瓶位統一工藝模式，一鍵操作即可實現多瓶位同步啟動/暫停/停止，高效完成對照試驗。   各瓶位間也可任意關聯操作，如圖示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工藝一關聯，達到三個瓶位同步運行的效果。 ⑤ 工藝預設： 配備十種配方工藝和四種自定義工藝，共計兩類步驟模式，滿足多步驟、多循環工藝需求。   參數可修改，斷電可保存，單步驟時間最高可達1000min,循環次數高達100次，操作便捷。 ⑥ 可編程工藝： 攪拌程序可編程、參數自定義。滿足間速模式／雙速模式／間恆速模式不同工藝需求，實現工藝條件的探索和優化。 ⑦ 雙語系統： 系統支持中英文雙語，一鍵切換，靈活便捷。 ⑧ 實時信息： 系統實時顯示每個瓶位的工藝參數：時間、轉速、工藝、步驟等。

【作者介紹】

通訊作者：浙江大學王斌教授。

共同一作：王斌教授課題組閆磊、李帝均、李松岩。

【關於韦德国际】

北京韦德国际生物科技有限公司成立於2018年，由清華大學生物工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學科技成果轉化，並憑藉此項技術榮登中國科協「科創中國」先導技術榜。作為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業、潛在獨角獸企業，更獲得國家科技部多項重點研發專項支持。

作為高質量三維細胞製造專家，韦德国际生物提供基於3D微載體的一站式定製化細胞規模化擴增整體解決方案，打造了原創3D細胞智造平台，實現規模化、自動化、智能化、密閉式的細胞藥物及其衍生品生產製備，以此幫助全球客戶建立最為先進的細胞藥物生產線。在開創【百億量級】幹細胞製備工藝管線後，加速向【千億量級】進發，致力於以3D細胞規模化智造技術賦能細胞與基因治療產業，惠及更多患者。