外泌體（Exosome, EXO）是一類直徑30-150nm的微小囊泡，能夠在活體中維持其內含物的生物學活性，且具有免疫源性低，安全性高、能跨越血腦屏障(BBB)等生物屏障等特點，是參與細胞間物質與信息傳遞的重要一環。因此在藥物遞送工具，疾病的新型診斷標誌物或是治療製劑領域，外泌體的基礎研究和臨床應用都呈現指數上升。

【外泌體的臨床應用仍面臨以下問題】

異質性：

人體中幾乎所有類型的細胞均能產生外泌體，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有很大功能區別，細胞經體外培養擴增，每次外泌體的分泌數量和類型是不同的，這可能導致不同批次間產品的異質性；

細胞製備工藝的影響：

細胞培養方式（二維培養、三維培養），細胞培養條件（細胞類型、細胞傳代、細胞密度、培養時間、培養基、外泌體收穫頻率）等都會顯著影響外泌體產品質量（產量、外泌體組成和外泌體的生物活性等）。生產條件的微小變化可能會對外泌體產品質量和活性產生相當大的影響；

外泌體分離純化方法選擇和優化：

目前針對外泌體的分離純化方法還沒有統一的方案，現在使用的差速超速離心法、密度梯度離心法、免疫親和法、聚合物沉澱法、超濾法等分離方法在操作性、處理量、純度及成本等方面各有優缺點。由於外泌體粒徑較小且與多種其他生物分子混合在一起，導致其分離純化困難，因此，高效生產且可擴展的應用於大樣本量外泌體的分離純化技術，是外泌體臨床應用所急需解決的問題；

外泌體的量化方案和質量標準：

目前對於分離獲得的外泌體主要從三個層面進行鑑定：

① 通過Western Blot（WB）來鑑定外泌體表面標誌物：CD9、CD63、CD81，內部標誌物：TSG101、ALIX等；

② 電鏡分析外泌體的形態特徵：茶托型或一側凹陷的半球形；

③ 通過NTA等手段分析樣品中細胞外囊泡的群體特徵：粒子濃度、直徑分佈等；

由於現在外泌體還缺乏統一的檢測方法和標準化的技術規範，基於外泌體異質性的特點，使得外泌體臨床前研究結果的有效性、可重複性以及結果的通用性依然存疑。因此對於外泌體的質量評價不能僅局限於檢測過程中，還應包括檢測前，即細胞或組織樣本的選擇問題，同時需要開發一種在單顆粒水平，快速、高通量檢測的方法來進行質量監控；

外泌體的儲存條件和方法：

提取後的外泌體的完整性和生物活性可能受到保存介質、保存溫度和時間等因素的影響，外泌體被提取後一般懸浮於磷酸鹽緩衝液，實驗室中常規的外泌體存儲條件一般是4℃、-20℃、-80℃；-20℃ 或更低溫度是比較可取的外泌體長期存儲條件。外泌體應根據其臨床轉化應用的方向、結合來源、劑型、給藥方式等因素，進行系統的儲存條件及方法的質量穩定性研究。

組織選擇及活體生物學分佈：

外泌體進入受體細胞後的轉歸、生物分佈、藥代動力學和靶向遞送器官分佈的特異性以及疾病的治療機制尚未完全闡明。

不同來源、不同給藥方式的外泌體，在體內顯示不同組織傾向的歸巢能力，這可能是與其膜表面受體和細胞外基質結合蛋白有關；由於外泌體是由體內細胞自然釋放的，因此也可以改造體內細胞以在體內釋放工程化外泌體，通過工程化改造外泌體表面蛋白或者化學結構可以使其在特定組織器官中更富集。

【基於以上挑戰，韦德国际生物可提供如下服務】

1、外泌體規模化、標準化製備

間充質幹細胞外泌體（MSC-Exos）基於其抑制炎症反應、激活抗凋亡和促存活途徑等促進組織修復和再生的作用，成為臨床轉化應用的熱點，但GMP級藥用MSC-Exos的生產仍然是行業一大挑戰。

MSC-Exos規模化應用開發關鍵在於兩點：

① 依賴於MSCs培養方式的規模化，

② 依賴於外泌體分離純化方法的提升。

與傳統的2D平面培養的MSC相比，採用韦德国际3D TableTrix®微載片及3D FloTrix®系列生物反應器培養的MSC顯示出更高的外泌體分泌量。

採用3D工藝在MSC-Exos的生產中具有以下優勢：

①可實現連續培養工藝，通過持續的培養基灌流，避免代謝副產物在生物反應器中積累，不同時間點連續收穫外泌體；

②可實時收穫間充質幹細胞，收穫符合幹細胞治療產品質量標準的間充質幹細胞的同時保證外泌體的質量；

③可實現單批次，同一時間收穫規模化外泌體產品，保證外泌體質量的均一性；

④結合3D FloTrix®vivaEXO外泌體收穫系統，可在數小時內，將10L細胞培養上清濃縮至500ml，高效收穫外泌體產品。

外泌體生產純化流程圖

1、外泌體的分離鑑定

根據國際細胞外囊泡研究協會（ISEV）針對囊泡研究提出的2018最小試驗要求（MISEV2018），以及國內《人間充質幹細胞來源的小細胞外囊泡》團體標準（中國研究型醫院協會），人間充質幹細胞外囊泡（EVs，含外泌體）鑑定包括以下內容：

① 形態：透射電鏡下應呈現不聚團的具有清晰膜結構的茶托狀或杯狀結構，邊緣清晰；

②粒徑：應分佈在小於 200nm 範圍內，且在範圍內存在粒徑峰值；

③ 標誌蛋白：小細胞外囊泡表面標誌物 CD9、CD81、CD63 中的任意兩個表達陽性；小細胞外囊泡內部標誌物 TSG-101、Alix 中的任意一個表達陽性；

④ 純度：小細胞外囊泡陰性標誌物 GM130 或Calnexin 應為陰性；小細胞外囊泡數量與蛋白量比值不低於 1×108個顆粒/微克蛋白；

⑤ 免疫調節：人間充質幹細胞來源的小細胞外囊泡與健康人來源的外周血單個核細胞共孵育，能抑制其增殖，抑制 Th1 細胞功能；

⑥ 微生物：HIV、HBV、HCV、HTLV、HEBV、HCMV、TP、真菌、細菌、支原體均應為陰性。

【韦德国际生物提供以下服務內容：】

① 規模化培養細胞質量鑑定；

② 納米顆粒跟蹤分析儀（NTA）檢測外泌體粒子濃度及粒徑範圍；

③ 免疫印跡(WB)檢測3D外泌體表面標誌物表達；

④ 透射電鏡（TEM）觀察3D外泌體結構；

⑤ 細胞培養上清中微生物、內毒素、支原體、蛋白濃度、細胞分泌因子等檢測；

迄今為止，治療性外泌體臨床應用還存在不一致的問題，包括外泌體生產的所有領域，如外泌體分離、量化和表徵的方法。規模化外泌體生產中標準化、簡化的製備過程是臨床前和臨床環境中外泌體治療產品結果可重複性的關鍵。

參考：

1. 《人間充質幹細胞來源的小細胞外囊泡》團體標準（中國研究型醫院協會）

 

 

✦ 3D TableTrix^®

 細胞微載片 

• 已分別獲得FDA DMF和CDE藥用輔料資質

• 彈性多孔結構，比表面積大

• 3D仿生，可定製化

• 特異性降解技術

• 無菌片劑包裝，無需預處理

 

 

✦ 3D FloTrix^®

 三維幹細胞培養基 

• 專為間充質幹細胞3D培養工藝定製

• GMP生產級別

• 無血清、無動物源成分

 

 

 

 

✦ 3D FloTrix^®vivaSPIN

 自動化生物反應器 

• 可實現3D細胞實時在線計數

• 高精度質量流量計，減少氣泡產生，適配於3D細胞動態培養工藝

• 3D TableTrix^®細胞微載體專用上清液過濾系統

• 具有審計追蹤功能，提供3Q認證，符合GMP規範

 

 

 

 

 

✦ 3D FloTrix^®vivaPREP

 細胞收穫系統

• 可實現連續式、封閉式、自動化細胞製備工藝

• 單批次可收穫10^9以上細胞

• 可完成清洗、濃縮、分裝等多種細胞處理工藝

• 內置審計追蹤功能，符合GMP規範

 

 

 

 

 

【關於韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，提供基於3D微載體的細胞規模化定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix®微載片（微載體），是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已通過中檢院等相關權威機構的檢驗報告，並獲得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20200000496）。同時，產品獲得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）。

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有5000平米的研發與轉化平台，其中包括4000平米的GMP生產平台，1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台；新建1200L微載體生產線。相關技術已獲得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已獲得多項國家級立項支持與應用。