細胞培養是科学生命中使用最常見和最複雜的技術之一，培養基是維持間充質幹細胞（MSCs）健康、增殖的關鍵因素。當把它全部分解，所有的MSCs培養基本質上包含相同的基本成分：基礎培養基、緩衝系統、谷氨酰胺、特定的生長因子和額外的補充劑、血清（或血清替代物）。

在這裏，韦德国际將對培養基中一些主要成分、培養基種類及選擇作一簡要綜述。

【MSCs培養基的主要成分】

Part1.基礎培養基

經典基礎培養基（DMEM、MEM、RPMI等）化學組分明確，每一種都可以用於支持特定的細胞系或培養條件。不同的經典基礎培養基之間的主要區別在於緩衝液、鹽和細胞生長添加劑的特性和數量。

許多基礎培養基最初是用小鼠成纖維細胞、HeLa或CHO細胞系開發的，隨着時間的推移，已經建立了適合各種細胞類型的基礎培養基。例如，DMEM/F12作為一種常用的幹細胞基礎培養基，它是複合培養基Ham’s F12與DMEM（含有更高濃度的氨基酸與維生素）1:1的混合物

Part2.緩衝系統

MSCs培養基不僅要滿足培養細胞的基本營養需求，而且要適合所使用的培養條件。大多數哺乳動物細胞在pH為7.4時生長良好，保持這個pH值對幹細胞培養至關重要。

當使用透氣培養瓶或培養皿時，大氣中的二氧化碳氣體溶解到細胞培養基中，並與HCO₃⁻建立平衡。因為二氧化碳是酸性的，所以介質的pH值會降低。雖然介質中的鹽和氨基酸可以给予一些緩衝能力，但仍需要添加額外的緩衝化合物。

① 碳酸氫鈉

為了維持CO₂培養箱中培養基pH值的穩定，碳酸氫鈉（NaHCO₃）是一種無毒的天然緩衝液，被添加到幹細胞培養基中。

根據研究，在5% CO₂培養箱中培養時，需要1.5 g/L的NaHCO₃來保持培養基的pH為7.4。

H₂O + CO₂ ↔ H₂CO₃ ↔ H+ + HCO₃－NaHCO₃ ↔ Na+ + HCO₃－

② HEPES

HEPES是一種兩性離子有機緩衝液，也用於維持細胞培養基的生理pH值。

當細胞培養系統非常敏感時，為了增加緩衝能力，使pH穩定在7.2至7.6範圍內，且不依賴於CO2水平時，建議使用HEPES。

③ 酚紅

除CO2水平外，細胞代謝物、培養基添加劑等多種因素也會影響MSCs培養基的pH值。因此，酚紅通常被添加到幹細胞培養基中，作為一種可視化的pH指示劑。

含有酚紅的培養基在pH為7.4時呈現紅色，並隨着pH的波動從亮黃色到深紫色。呈現黃色或粉紅色/紫色的培養基一般不適合幹細胞，此時需要立即進行培養基交換、傳代或培養箱氣體調節等。

圖1.酚紅pH值圖 含酚紅的介質在pH為7.4時呈現紅色，隨着pH值的變化從黃色到紫色。

Part3.谷氨酰胺

細胞需要氮來構建核苷酸、氨基酸和維生素。L -谷氨酰胺是一種必需的氨基酸，是大多數細胞培養基的必需添加劑，可促進培養中氮的儲存以及轉移到細胞中。當葡萄糖水平低而能量需求高時，尤其是對於快速增殖的細胞類型或在缺氧條件下培養的細胞，谷氨酰胺也是最容易取得的氨基酸之一。但是，當溶解在液體介質中，游離L -谷氨酰胺是相當不穩定的。在4°C以上時，細胞培養基中的L-谷氨酰胺可降解為有毒的銨和焦谷氨酸鹽副產物。由於半衰期短，所以L -谷氨酰胺原液必須在-20°C冷凍保存，在使用前添加到新鮮製備的培養基中。

Part4.生長因子與其他添加劑

① 生長因子

生長因子、細胞因子和趨化因子作為細胞的化學信使，是細胞自然分泌的小蛋白質分子，對接收信號的細胞誘導生理效應（增殖、生長或分化）。不同幹細胞需要補充特定生長因子的培養基以維持培養物的健康、增殖和分化。例如，鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF）是維持人胚胎幹細胞（ES）和誘導多能幹細胞（iPS）多能性的關鍵生長因子，而白血病抑制因子（LIF）是小鼠ES和iPS細胞的主要調節因子。

幹細胞培養基中使用的生長因子的質量對培養效果有重要影響。細胞培養基中使用的生長因子大部分是重組蛋白，可以在多種類型的細胞和物種中合成，包括大腸桿菌、CHO和人系。使用高活性、高純度、適當的蛋白質摺疊和翻譯後修飾的生長因子，可以取得最佳效果。生長因子和細胞因子作為凍乾粉儲存時是穩定的，但一旦加入培養基，保質期很短。為了避免這些成分的降解，準備小等分的濃縮原液，並在使用前添加到培養基中以達到最佳效果。

② 氨基酸

除了基礎培養基中给予的必需氨基酸和補充的谷氨酰胺、生長因子外，培養基中還經常添加非必需氨基酸（NEAA），以刺激細胞增殖和延長培養細胞的活力。雖然細胞可以自然合成NEAA，但在培養基中補充NEAA可以減少氨基酸水平低時可能影響細胞生長的潛在副作用。

③ 抗生素

實驗室經常顺利获得補充抗生素來控制細胞培養環境中可能出現的細菌污染物的生長。除了原代細胞分離，在幹細胞培養中不需要或不鼓勵使用抗生素。常規使用抗生素可以掩蓋低水平的細菌污染，產生耐藥菌株，掩蓋支原體污染的影響，甚至干擾細胞代謝。

Part5.血清與血清代替物

傳統MSCs培養基中一般會添加胎牛血清（FBS），FBS中含有生長因子、激素、黏附蛋白和其他對細胞增殖和維持至關重要的因子。

但是，使用源自動物的胎牛血清只適合於體外研究，而不適用於人類臨床應用，主要因為：

① 攜帶異種成分的胎牛血清注入人體內可引起免疫反應；

② 胎牛血清可能攜帶動物源性病原體，如細菌或病毒，可在細胞培養過程中傳播到間充質幹細胞；

③ 胎牛血清中未確定的成分和批次間的差異會影響研究結果和治療結果的準確性[1]。

因此，將傳統含FBS的MSCs培養基替換為更安全、能有效維持MSCs特性的無血清培養基，以供臨床應用，至關重要。

【MSCs無血清培養基的種類】

無血清培養基的研究主要有兩個方向：

① 培養基中不含有任何動物來源的添加組分；

② 培養基中不含有任何不明確的添加組分。

根據研究方向，可以將其歸納為四種（圖2）：

①一般意義上的無血清培養基（Serum-free, SF）：添加物質的化學成分不明確，其中可能含有大量的動物來源蛋白；

②無異種成分培養基（Xeno-free, XF）：不含動物源性成分，但可能含有人類源性成分；

③無動物成分培養基（Animal component-free, ACF）：不含任何來自動物或人類的成分；

④化學成分限定培養基（Chemically defined, CD）：所有化學成分明確，濃度確定。

                   圖2：培養基開發方向

隨着臨床應用對MSCs的需求日益增加，新型的MSCs培養基製備技術應運而生。现在，開發MSCs無血清培養基有兩種策略。

策略一：用取自人血的“人源化”補充劑或植物蛋白水解物（HVP）替代胎牛血清，如人血小板裂解物（HPL）或小麥蛋白水解物。

① HPL

HPL是一種來源於人血小板的無異種源、無動物血清的細胞培養基添加物，可用於開發無血清/無異種成分培養基。HPLs可以從血庫收集，那裏有不適合病人輸血的過期的血小板。

HPLs中含有大量的細胞因子、生長因子和蛋白質等物質（表1），可促進MSCs生長，同時保持其分化潛能和免疫調節特性。

② HVP

HVP是將小麥、大豆、大米等植物原料，在酸或酶製劑的催化作用下，水解得到的氨基酸及氨基酸多肽的中間混合膠體，再經加工處理後得到的產物。

如小麥蛋白水解物作為血清替代物，含有豐富的二肽與多肽，相對於游離氨基酸，這些是MSCs更喜歡的營養。而且，小麥蛋白水解物富含有包含多肽的穩定型谷氨酸鹽，被認為是細胞培養中重要的核酸原料，同時也是極好的能量來源。植物蛋白水解物可用於開發無動物成分培養基。

策略二：只使用合成的、重組的或人類衍生的純化物質來配製培養基，而不添加血清或血清替代物作為補充劑。

這種培養基即為化學成分限定培養基，它的主要優點為化學成分明確，濃度明確，可精確定量，對每次檢測都保證其穩定性，不存在批間差異；同時，它也避免了引入動物源性病原體的可能性。由於此類培養基中缺乏粘附蛋白，大多數需要添加合適的包被液來促進間充質幹細胞的貼壁和遷移。

现在，已上市了多款無血清/無異種（SF/XF）及化學成分限定（CD）培養基用於MSCs的培養及擴增（表2），但這些培養基的效果還有待商榷[2]。例如，有研究表明，原代MSCs在StemPro MSC SFM或mTeSR培養基中的培養效果不佳，需要另加人AB血清進行培養，而且，間充質幹細胞傳代需要較高的細胞接種密度，密度較低會減慢細胞增殖。也有研究報道，MesenCult-XF對間充質幹細胞的分離、擴增、表型和分化潛能並沒有很好的支持。  

【MSCs培養基的選擇】

一款理想的MSCs培養基應滿足以下標準：

① 無血清；

② 無異種成分；

③ 化學成分明確；

④ 支持MSCs原代培養；

⑤ 支持MSCs在低接種密度下傳代；

⑥ 無需提前包被，可促進MSCs貼壁生長；

⑦ 該培養基性能大於或類似於含FBS培養基。

MSCs被廣泛應用於創傷組織修復、免疫疾病、糖尿病、癌症等各類疾病，使得對MSCs的需求急劇升高。對細胞療法而言，安全性、有效性及可重複性是首要考慮的，臨床級的培養基製劑可顯著提高移植幹細胞的安全性和質量，批次穩定、成分確定的無血清/無異種培養基將是臨床應用的最優選擇。由於培養基的複雜性，這將是一個困難的過程。

參考文獻

[ 1 ]

H. T. H. Bui, Nguyen, L. T., Than, U. T. T. Influences of Xeno-Free Media on Mesenchymal Stem Cell Expansion for Clinical Application[J]. Tissue Eng Regen Med,2021,18(1):15-23.

[ 2 ]

X. Wu, Kang, H., Liu, X., Gao, J., Zhao, K., Ma, Z. Serum and xeno-free, chemically defined, no-plate-coating-based culture system for mesenchymal stromal cells from the umbilical cord[J]. Cell Prolif,2016,49(5):579-588.

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