【Part1 引言】

01 背景簡介

內源細胞較少的組織缺乏恢復其完整機械強度和功能的內在能力，因此造成了相關病症的臨床問題和醫療負擔，因此基於幹細胞的療法為治療各種組織損傷给予了巨大的臨床前景。

肌腱幹細胞(TSPCs)是在肌腱中發現的一種特殊幹細胞群，不僅具有多能性和自我更新能力，而且還具有成腱表型，是肌腱再生的理想種子細胞。

02 面臨的瓶頸：2D傳統細胞培養模式

擴大足夠數量的TSPCs用於臨床治療，同時保留其乾性和成腱表型仍然是一個重大挑戰：常用的二維單層培養TSPCs的條件不能模仿三維生理條件，這可能導致肌腱相關基因的表達喪失，導致再生能力下降。此外，二維培養皿生長表面很小，因此不可能安全、經濟地生產幹細胞，也不可能有足夠的規模來滿足未來基於幹細胞的臨床治療的細胞劑量要求。

03 解決的方法：3D微環境細胞培養模式

為了更好地再現幹細胞培養體內微環境的關鍵特徵和功能，3D微環境已受到相當大的關注。3D微環境是一種新穎的幹細胞培養方法，因為它們體積小但表面積大，而且易於操作。此外，與傳統的二維微環境相比，给予了仿生的微環境，以形成充分的細胞-細胞和細胞-ECM相互作用的細胞培養。

【Part2 文獻解讀】

在本期所描述的文獻中，研究者顺利获得使用韦德国际生物3D明膠微載體培養系統培養了人類肌腱幹細胞（hTSPCs），發現3D明膠微載體培養體系培養的hTSPCs在體內外均表現出了卓越的幹細胞特性和功能，明顯優於傳統2D方式培養的hTSPCs，進一步探索了相關機制。

01 材料與方法

研究者使用來自韦德国际生物的3D TableTrix® 微載體作為細胞培養的3D微環境進行細胞培養，進一步作者對3D微環境擴增的細胞進行了細胞活力與增殖能力評估、分化能力評估、流式表型分析、免疫熒光染色、轉錄組分析，此外研究者還進行了動物實驗，對體內形成的肌腱進行了一系列表徵。

02 實驗結果

3D微載體為hTSPC培養给予了一個優秀的平台

圖1：細胞增殖倍數曲線以及活死染色熒光圖像

3D組的hTSPCs更傾向於年輕幹細胞而不是衰老乾細胞：免疫熒光染色顯示，與2D組相比，3D組的hTSPCs具有較少的擴散形態，表現為細胞面積和體積明顯較小，核質比和球形度明顯改善。

圖2：免疫熒光染色後hTSPCs的3D共聚焦圖像

圖3：培養4天後，hTSPCs 2D及3D培養細胞的細胞體積（左）和核質比（右）

圖4：培養4天後，hTSPCs 2D及3D培養細胞的細胞面積（左）和球形度（右）

3D微載體擴增的hTSPCs表現了更好的成腱分化能力

● 增強了成肌腱相關的基因表達，標誌物含量相對2D培養方式增加。

 免疫熒光染色法證明，3D組中肌腱特異性標誌物的表達明顯提高。

圖5：肌腱誘導7 天，TNMD、COL1和COL14的免疫熒光染色

肌腱相關基因的表達在3D微環境中明顯更高。

圖6：培養4天後，對hTSPCs的SCX、FOS、DCN和TNMD進行qRT-PCR分析

● 3D培養的hTSPCs新細胞群結構有助於增強其成腱能力。

研究者比較了3D組和2D組中每個亞群的比例。雖然CKS2+CENPF+亞群在2D組明顯富集，但其他集群在3D組更豐富，其中ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亞群在3D組佔優勢。在ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亞群中，肌腱相關基因的表達增加，但在CKS2+CENPF+亞群中，這一表達較低。

圖7：UMAP圖hTSPCs分成五個亞群（左）以及其佔比柱狀圖（右）

圖8：相關基因表達的點陣圖及小提琴圖

● 3D微環境激活的FGF7信號，顺利获得細胞間相互作用提高了其成腱能力。

研究者發現3D微環境顺利获得激活FGF7來增強成腱表型。整合素介導的FGF7旁路調節ICAM1+ITGB8+FGF7+和FGF7+CYGB+亞群中的ERK MAPK/PI3K/STAT信號，從而顺利获得細胞-細胞間的相互作用增強了3D微環境中hTSPCs的成纖維表型。

圖9：整合素-FGF7-ERK MAPK/PI3K/STAT信號轉導有關的基因表達情況（左），ICAM1+ITGB8+FGF7+亞群中整合素-FGF7-ERK MAPK/PI3K/STAT信號基因交互網絡（右）

3D微載體擴增的hTSPCs有更優秀的體內肌腱形成能力

研究者進行了動物實驗，在術後兩周和四周進行了相關表徵檢測。

圖10：動物實驗示意圖

術後兩周後

3D組在修復部位表現出密集且排列整齊的再生肌腱，宏觀形態上幾乎沒有炎症和腫脹，2D組&對照組則表現出鬆散、排列不整齊的軟組織，有圓形的細胞和一些血管，有明顯的炎症和腫脹。3D組比2D組和對照組的膠原纖維更大、更整齊。

圖11：術後兩周修復的大鼠髕骨肌腱的H&E、Masson和偏振光的代表圖像

圖12：術後兩周肌腱組織內膠原纖維的橫截面與縱截面的TEM圖像

圖13：術後兩周肌腱組織內膠原纖維的平均直徑以及分佈

圖14：術後兩周內膠原纖維方向的角度分佈

術後四周後

與兩周時的肌腱相比，3D組的修復肌腱更加緻密，有更多的紡錘形細胞沿拉伸負荷軸線分佈，宏觀形態上炎症較少，2D組對照組的再生肌腱則充滿了多細胞和雜亂的膠原纖維，有一些炎症和腫脹。

圖15：術後四周修復的肌腱的代表性H&E、Masson和偏振光圖像

在核磁共振（MRI） T2加權圖像中，三維組的再生肌腱表現出低強度、均勻的信號和清晰的邊緣，與健康肌腱相似；而二維組和對照組的再生肌腱則表現出不規則的輪廓和異質的高強度信號，表明這兩組的損傷和炎症仍然存在。

圖16：修復後的髕骨肌腱的T2加權MRI掃描及其半定量數據MRI圖像（A），高或中等強度信號區（AHS）和總縱向區域（AT）的比率分析（B，D）以及腱內病變的強度（C，E）。紅色箭頭表示肌腱區域。

與二維和對照組相比，三維組具有更好的生物力學性能。3D組的剛度、破壞時的應力和破壞力都明顯高於其他組。三維、二維和對照組的模塊分別為正常大鼠髕腱的42.74%、14.05%和14.24%。三維組破壞時吸收的能量分別比二維組和對照組高2.53倍和3.06倍。二維組和對照組的機械性能沒有明顯差異。

圖17：術後四周再生的髕骨肌腱的機械性能：剛度 | 破壞時的應力 | 破壞時吸收的能量 | 破壞力 | 模量 

03 結論

本研究顺利获得hTSPCs的3D微環境培養發現3D微環境調控幹細胞功能的相關機制，關鍵細胞亞群的改變和FGF7的激活對於提高hTSPCs的成腱能力至關重要。

3D TableTrix® 微載體作為3D微環境生產的hTSPCs有更好的細胞活率，增殖倍數，細胞也更年輕，且有更強的乾性，體內實驗也表現出了更優秀的生物學有效性。

參考文獻：

Hong Zhang, Yangwu Chen, Chunmei Fan, et al. Cell-subpopulation alteration and FGF7 activation regulate the function of tendon stem/progenitor cells in 3D microenvironment revealed by single-cell analysis. Biomaterials. 2022 Jan;280:121238.

圖片來源：

文中所附研究說明相關圖表，均來自文獻原文。

原文連結：

10.1016/j.biomaterials.2021.121238

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