【背景】

傳統培養工藝下，貼壁細胞通常使用細胞培養瓶、滾瓶、或細胞工廠等進行培養，培養規模相對有限，培養過程難以控制，且難以在保障質量可控的前提下進行工藝放大。使用微載體結合生物反應器進行貼壁細胞的懸浮式培養，是一種非常好的解決方案。

韦德国际生物面向病毒類生物製品行業推出首款3D多孔可降解微載體——3D TableTrix® 微載體V01，不僅可用於貼壁細胞的育種與收穫傳代，還可用於病毒生產。

3D TableTrix® 微載體V01

與傳統微載體相比，在細胞擴增、產毒方面優勢明顯。用於Vero細胞大規模培養，細胞密度均可達到1× 10⁷cells/mL以上，細胞在生物反應器中可穩定逐級放大，最終實現分泌型病毒和胞內病毒高滴度生產。

圖1：3D FloTrix® 細胞大規模培養技術用於病毒生產

【產品特點】

1：呈蜂巢狀多孔結構, 孔徑範圍30~50μm，孔隙率＞90%；

2：比表面積高達9000cm²/g以上，約等同於傳統微載體表面積2~3倍，可在同等投料密度下给予更多有效生長空間，承載更多貼壁細胞；

3：微載體可完全降解，可给予由中檢院核驗的微載體降解殘留檢測方法（試劑盒）。實現無損收穫細胞，可代替細胞工廠用於細胞育種和建立種子庫；

4：具有仿生的生物力學特性，可有效緩衝攪拌式反應器中的流體剪切力與微載體間的碰撞作用，更充分地保障細胞活率，從而提高病毒產量；

5：放大工藝簡單，細胞可實現罐轉罐放大，全封閉工藝有效避免染菌風險；

6：支持濕熱在線滅菌，可用於不鏽鋼反應器的大規模生產使用。

Part.1 微載體用於Vero細胞大規模培養工藝的建立

細胞育種

◉ 使用10層工廠進行細胞育種，培養72h後用於反應器接種。

培養液

◉ 接種培養基為含10%NBS的SFM培養基，換液培養基為含1%NBS的SFM培養基。

微載體

◉ 3D TableTrix® 微載體V01,密度：2g/L。

細胞密度

◉ 微載體2g/L條件下，推薦細胞接種密度為25萬-40萬/mL。

接種條件

◉ 40rpm 5min，0rpm 25min循環8-16h後，調節為恆速45rpm。

細胞培養

◉ 細胞培養過程中每天取樣計數並檢測葡萄糖含量，葡萄糖含量低於1g/L時使用換液培養基進行換液，換液體積為總培養體積的80%。

放大比例

◉ 1 ：5

原位傳代

◉ 細胞增殖4-5天，增殖倍數達8-10倍時，可以進行原位傳代。

◉ 傳代前先對微載體進行計數，計數方法為胰酶降解載體計數。

◉ 計數後沉降微載體，PBS清洗3次，用細胞消化酶消化約30min，細胞從微載體脫落，使用完全培養基終止消化。

◉ 根據下一級接種所需細胞將合適體積的細胞載體懸液轉移至下一級反應器。

三級增殖效果

◉ Vero細胞可實現三級放大，且細胞增殖穩定。

◉ 細胞生長8天最高可實現1.37×108cells/mL密度（圖2）。

圖2.Vero大規模擴增細胞增殖曲線

◉ 第一次轉罐回收率93.8%；

◉ 第二次轉罐回收率100%，且細胞維持較高活性（圖3）。

圖3.Vero大規模擴增細胞增殖和消化熒光圖

Part.2 微載體用於Vero細胞大規模培養工藝的優化

為了進一步降低經濟成本和操作複雜性，在原接種工藝上對接種培養基及換液培養基進行優化，將接種培養液血清濃度降低至3%，換液培養基不使用血清，並進一步放大培養比例至1:8。

由於換液時不使用血清，傳代消化時也可將清洗次數由3次降低到1次，有效的節省試劑耗材成本和操作時間。

工藝優化後擴增結果：不添加血清不影響細胞的增殖效率，細胞生長5天可實現5.42×106cells/mL密度（圖4）。傳代時PBS清洗一次不影響消化效率轉罐回收率為93.3%，且細胞維持較高活性。

圖4.工藝優化後細胞增殖曲線

Part.3 微載體用於豬流行性腹瀉病毒（PEDV）生產

使用3D TableTrix® 微載體V01培養Vero細胞72h（Day 3）後，密度增殖到2.5×106cells/mL左右接種PEDV, 接種後每天收取上清檢測滴度，取得病毒滴度峰值，並做二維產毒對比。

用於生產PEDV結果：病毒接種後微載體上的細胞逐漸病變脫落，接毒後160h微載體上的細胞幾乎完全脫落（圖5）。

圖5. 接種PEDV前後細胞狀態

病毒滴度最高可達108.57 TCID50/mL，比二維平面工藝最高提高100倍以上（圖6）。

圖6. 兩種培養方式PEDV滴度對比

Part.3 微載體用於Vero細胞大規模培養工藝的優勢

1：細胞增殖迅速，5天可以實現10倍增殖。

2：90%以上的細胞回收率保證較高的放大比例。

3：轉罐操作簡便，1-2人即可操作，節省人力成本。

4：血清用量少，有效降低成本。

5：用於病毒生產可以顯著提高病毒滴度，進而提高病毒生產效率。

基於韦德国际微載體的Vero細胞大規模培養工藝，在微載體密度2g/L，細胞接種密度30萬/ml條件下，採用無血清培養基培養5天細胞即可增殖10倍，顺利获得罐內消化的方式傳代，細胞回收率均在90%以上。

在顺利获得此工藝培養Vero細胞用於豬流行性腹瀉病毒生產時病毒滴度顯著優於二維平面培養的細胞。本工藝載體用量少，操作簡單，同時可降解載體收穫細胞，滿足不同疫苗生產工藝需求。

【總結】

3D TableTrix® 微載體V01在Vero細胞的培養中表現出了較好的優勢，相對於現有的的培養方式，使用相對低密度的V01微載體即可實現細胞的大規模擴增，且微載體可降解，實現細胞的無損收穫，工藝簡單，易於放大。

憑藉3D TableTrix® 微載體V01配合3D FloTrix® 自動化生物反應器的獨特優勢，在滿足疫苗產業對於細胞數量和質量需求的同時，大大降低人工、時間及儀器耗材等成本。這為疫苗企業给予了新選擇，帶來了新動力。

【產品資質】

韦德国际生物的核心產品3D TableTrix® 微載體，源於清華大學科技成果轉化，可作為細胞生長的微環境(Microniche) 實現細胞體外高質量擴增。

該產品已取得：

• 2項國家藥監局藥用輔料資質：CDE審批登記號為【F20200000496、F20210000003】；

• 1項美國FDA-DMF藥用輔料資質：備案號為【DMF-35481】。

藥用輔料資質

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將有技術專家為您给予解答和幫助。

【關於韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，给予基於3D微載體的細胞規模化、定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix® 微載體，是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已顺利获得中檢院等相關權威组织的檢驗報告，並取得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20200000496）。同時，產品取得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）、培養基取得FDA DMF備案（DMF：038476）。

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有5000平米的研發與轉化平台，其中包括4000平米的GMP生產平台，1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台；新建1200L微載體生產線。相關技術已取得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已取得多項國家級立項支持與應用。