【前言】

微載體是直徑50到300μm，密度略大於水，表面可供貼壁細胞貼附生長的微珠材料。與傳統二維基質材料相比具有更高比表面積，在同等規模的培養容器內可培養更多數量的細胞，並且可搭配生物反應器實現細胞大規模懸浮培養，有效節約人力、物力、空間成本。

微載體細胞培養技術流程包括：細胞接種、細胞增殖和細胞收穫三個主要階段。其中，細胞接種是將種子細胞加入含有微載體的培養容器，使細胞貼附到微載體表面的過程。選擇適宜的接種工藝條件，使細胞能夠高效、均勻地貼附微載體（圖1），從而充分利用微載體的比表面積，成為保證後期細胞大規模擴增的重要前提。

圖1：細胞貼附在3D微載體表面（圖源：韦德国际生物，侵權必究）

下面韦德国际將簡單介紹微載體培養技術中不同接種工藝參數對於細胞接種效果的影響，為大家選擇適宜的接種工藝條件给予參考。

【PART 1：細胞狀態】

一般而言，用於接種微載體的種子細胞應儘量選用處於指數生長期、而非平台期的細胞。據文獻報道，接種處於指數增長期、而非長至匯合的細胞，微載體培養細胞產量可能提高2-3倍[1]。

同時，為保證貼附均勻度，應採用單細胞懸液、而非細胞團塊接種微載體。如採用二維貼壁培養方式育種，應保證貼壁的細胞經過蛋白酶（如胰蛋白酶）充分消化為圓形單懸細胞，而非僅限於將細胞從培養表面脫附。否則，脫附但未經充分消化的細胞可能仍保持細胞-細胞間貼附，自髮結團，無法均勻貼附微載體。

需要注意的是，蛋白酶消化時間過長可能會對細胞活力造成損傷，甚至誘導細胞(如一些種類的幹細胞)凋亡，因此需要針對不同細胞特點選擇適宜的消化酶和消化時長，以儘量保持細胞活性[2]。

【PART 2：微載體濃度│細胞密度│細胞-微載體比例】

微載體培養細胞的產量上限與細胞生長總面積、也即微載體總表面積直接相關，同時也受到培養基用量的制約。因此，微載體濃度和細胞密度並非越高越好，而是應選擇最大化利用培養基營養，同時保證體系內溶氧、pH等環境參數穩定的濃度或密度。

市場上多數廠商推薦的微載體濃度為每升培養基1至6克微載體。而接種細胞密度除了受到培養基用量和微載體濃度影響外，還受細胞本身貼附速率、生長特性影響，一般建議每毫升接種104-106個細胞。

在接種初期，細胞-微載體的個數比例會直接影響細胞的貼附效率和均勻度。

◆ 過低的細胞-微載體比例會導致部分微載體無法被細胞貼附，降低微載體表面利用率和後續細胞增殖倍數。據理論估算，如果細胞-微載體比例低至1:1，體系內最終將有36.5%的微載體沒有細胞貼附；而若將細胞-微載體比例提升至4:1，這一比例會下降到1.8%[3]

◆ 由於微載體表面積有上限，接種的細胞-微載體比例也不必過高，以免浪費細胞。經驗顯示，不同種類細胞、或同種細胞在不同類型微載體表面的最適接種比例均有差異[2]。例如，猴腎VERO細胞接種實心球型微載體的最適細胞-微載體比例不低於8:1[4]，接種多孔微載體的最適比例則為30:1至60:1[5]。

现在，大部分微載體廠商都會给予微載體產品的單位質量顆粒數信息，用戶可根據微載體用量計算適宜的接種密度。

【PART 3：攪拌模式與攪拌速率】

槳葉攪拌式生物反應器是最常與微載體聯用的細胞培養平台。在接種階段，應適當攪拌培養體系，使細胞與微載體充分接觸，幫助細胞高效、均勻地貼附微載體。接種階段的攪拌模式可分為持續攪拌和間歇攪拌。

◆ 間歇攪拌模式是指間歇性開啟槳葉進行短時間攪拌，其餘時間關閉槳葉保持靜態培養，如此循環數小時至一天，到接種完成後改為持續攪拌模式。間歇攪拌模式使細胞有充足時間在靜止狀態下貼附微載體，適合細胞貼附微載體速率較慢或接種密度較低的情況，已被廣泛應用於間充質幹細胞（MSCs）、多能幹細胞（PSCs）、胚胎幹細胞（ESCs）培養[2]。

◆持續攪拌模式則更適合細胞貼附微載體速率較快的情況。一項針對VERO細胞在兩款不同微載體表面貼附均勻度的研究顯示，對於VERO細胞貼附速率更快的一款正電荷修飾的實心球型微載體，採用持續攪拌模式取得的細胞貼附均勻度優於間歇攪拌模式；而對於另一款細胞貼附速率較慢的基於ECM材料的多孔微載體，這一結論則正好相反[5]。

由此可見，接種階段的適宜攪拌模式受到細胞貼附速率、接種密度等參數的影響。而細胞貼附微載體速率又與貼附原理（如電荷吸附或細胞-ECM相互作用等）和微載體特點（如實心或多孔）有關。故應結合細胞、微載體的特點綜合選擇攪拌模式。

除攪拌模式外，攪拌速率也是影響細胞接種效果的重要因素。

◆ 細胞攪拌速率過低，微載體無法與細胞充分混合，細胞容易自發沉降結團，無法貼附均勻[6]。

◆ 高攪拌速率，會增大細胞承受的剪切力，可能造成細胞損傷或其他應力誘導的細胞性質變化，影響細胞質量[7]；同時，細胞在高剪切力作用下更易從微載體表面脫附[6]。

故應在保證微載體可以充分動態懸浮的前提下，採用儘量溫和的攪拌速率輔助接種。

【總結】

微載體培養技術中的接種效果受到細胞狀態、微載體濃度、細胞密度、細胞-微載體比例、攪拌模式與攪拌速率等多種工藝參數影響。

技術人員應充分分析細胞貼附微載體的基本原理，綜合考慮細胞及微載體特性，選擇適宜的接種工藝條件，以確保最優細胞培養效果。

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【參考文獻】

[1]Clark J., Hirtenstein M., Gebb C. Critical parameters in the microcarrier culture of animal cells. Dev. Biol. Stand. 46, 117-124 (1980)

[2]Derakhti S., Safiabadi-Tali S. H., Amoabediny G., Sheikhpour M. Attachment and detachment strategies in microcarrier-based cell culture technology: A comprehensive review. Mater. Sci. Eng. C 103, 109782 (2019)

[3]Panchalingam K. M., Jung S., Rosenberg L., Behie L. A. Bioprocessing strategies for the large-scale production of human mesenchymal stem cells: a review. Stem Cell Res. Ther.6, 225 (2015)

[4]Mendonca R. Z., Prado J. C. M., Pereira C. A. Attachment, spreading and growth of VERO cells on microcarriers for the optimization of large scale cultures. BioProcess Eng. 20, 565-571 (1999)

[5]Ng Y-C., Berry J. M., Butler M. Optimization of physical parameters for cell attachment and growth on microporous microcarriers. Biotechnol. Bioeng.50, 627-635 (1996)

[6]Heathman T. R. J., Nienow A. W., Rafiq Q. A., Coopman K., Kara B., Hewitt C. J. Agitation and aeration o stirred-bioreactors for the microcarrier culture of human mesenchymal stem cells and potential implications for large-scale bioprocess development. Biochem. Eng. J. 136, 9-17 (2018)

[7]Martin C., Olmos E., Collignon M-L., De Isla N., Blanchard F., Chevalot I., Marc A., Guedon E. Revisiting MSC expansion from critical quality attributes to critical culture process parameters. Process Biochem. 59, 231-243 (2017)