【前言】

近期，由北京中醫藥大學中醫學院王婧宇副研究員團隊在Pharmaceutics期刊上【IF：5.4】，發表了題為「基於3D生物反應器規模化生產小細胞外囊泡遞送人參皂苷Rg1治療阿黴素誘導的心臟損傷」的文章。

原文連結：

http://doi.org/10.3390/pharmaceutics16050593

【Part1 研究背景】

阿黴素（DOX）作為一線抗腫瘤藥常用於乳腺癌和淋巴瘤等多種癌症的治療，但其存在誘發心臟毒性等副作用。现在經FDA批准，治療阿黴素誘導心臟毒性(DIC)的唯一藥物是右丙亞胺，又因其存在繼發惡性腫瘤的風險而臨床應用受限，因此迫切需要開發更有效、更安全的DIC治療方法。

間充質幹細胞(MSCs) 來源的小細胞外囊泡(sEVs)已被廣泛用於心血管治療，保護受損的心肌細胞免受凋亡，但sEVs的低產量和高消耗阻礙了它們的應用。因此開發一種大規模生產系統，以提高MSC-sEVs產量，成為有助于其更好地應用於疾病治療的重中之重。

3D多孔微載體具有三維立體結構及更大的比表面積，支持細胞貼附生長，為細胞给予更適宜的生長環境，更增加了細胞生長空間，有效提升細胞培養質效，快速收穫MSCs和MSC-sEVs，有效解決sEVs產量低的應用難題。基於3D多孔微載體、配合自動化生物反應器的三維動態培養體系更已在大規模細胞生產製備中得到廣泛應用。

人參皂苷Rg1是從人參中分離得到的一種化合物， 人參皂苷Rg1已被證明在各種類型的損傷後對心肌細胞具有保護作用，但由於口服生物利用度低和半衰期短，阻礙了臨床應用，因此本研究基於sEVs的藥物遞送功能，負載遞送人參皂苷Rg1以提高DIC的治療效果，從而克服sEVs消耗高的應用瓶頸。

【Part2 研究方法】

本研究使用來自韦德国际生物的3D微載體和自動化生物反應器進行3D細胞動態培養，同時對3D-MSCs的細胞活力、細胞產量進行檢測，對3D-MSsC的生物標記物進行流式分析。

收集細胞上清，顺利获得超速離心法進行sEVs的分離，顺利获得TEM、NTA、WB等技術進行sEVs的表徵鑑定。隨後顺利获得電穿孔法和HPLC進行載藥平台構建。

顺利获得CCK-8、流式細胞術、全自動活細胞成像技術等檢測H9c2心肌細胞的細胞活力、細胞凋亡、細胞增殖情況，進行一系列的藥效評價。

【Part3 研究結果】

3.1 3D生物反應器規模化培養MSCs

為了實現sEVs的大規模生產，本研究選擇韦德国际生物的動態生物反應器3D培養擴增人臍帶來源的MSCs，同時進行常規2D培養作為對照（圖1A）。3D細胞培養系統包括多孔微載體和旋轉生物反應瓶 (圖1B)。Calcein-AM/PI染色結果表明3D-MSCs在陆续在培養過程中呈增殖狀態，且細胞活力有所增加( (圖1C、D)。在3D培養系統中，第5天的活細胞總數達到6億個，與第0天相比增加了約7.5倍(圖1E)。綜上所述，3D細胞培養系統實現了MSCs的規模化生產。

圖1：MSCs的規模化生產

為了驗證3D培養不影響MSCs表面標記物的表達，收穫2D-MSCs和3D-MSCs進行流式表型分析。結果表明，與2D-MSCs相似，95%以上的3D-MSCs表達CD73+、CD90+和CD105+，CD14−、CD34−、CD19−、CD45−和HLA-DR−陰性表達的比例不超過2%(圖2 A、B)。這驗證了從3D培養系統中收穫的MSCs能夠在培養擴增的過程中維持MSCs的生物學特性。

圖2：MSCs的流式表型鑑定

3.2 3D生物反應器實現了sEVs的大規模生產

隨後，韦德国际收集2D-MSCs和3D-MSCs的條件培養基，採用差速超速離心法提取sEVs，並顺利获得TEM、WB和NTA技術進行表徵鑑定，這些實驗結果證實了從3D細胞培養系統不會影響sEVs的生物學特性（圖3）。

根據NTA結果進行統計分析可知，當同時各自投入相同數量（8 × 10⁷）的細胞時，3D培養系統所需耗材僅為4 個500 ml的生物反應瓶，而2D培養系統需要132個T75培養瓶。一個實驗者同時獨立操作132個T75培養瓶是一個巨大的挑戰，因此2D培養的可實現性低，這也反應出了3D培養可以降低人力物力和時間的投入。3D培養系統收穫的sEVs總顆粒數和蛋白總量約是2D培養系統的2倍，實驗時間減少了8倍。這提示着3D培養系統可以實現MSCs和sEVs的大規模生產，降低人力、物力和空間的投入，顯著提高了實驗效率（表1）。

圖3：sEVs的提取與表徵

表1. 2D vs 3D培養系統中sEVs產量統計對比

3.3 3D-sEVs抑制H9c2心肌細胞凋亡，減輕DOX的心臟損傷

隨後，韦德国际進行3D-sEVs治療DIC的藥效評價(圖4A)。第一时间構建了DIC體外細胞模型(圖4B)，並驗證了3D- sEVs可被H9c2心肌細胞快速攝取(圖4B)。CCK-8 (圖4D)和流式細胞術 (圖4E-G)結果表明3D-sEVs抑制了DOX誘導的心肌細胞凋亡，對受損的心肌細胞起到了很好的保護作用。

圖4. 3D-sEVs治療DIC的藥效評價

3.4 人參皂苷Rg1抑制心肌細胞凋亡，促進心肌細胞增殖，減輕DOX心臟損傷

接下來，韦德国际評價了人參皂苷Rg1對DOX誘導的心肌損傷的保護作用。CCK8結果表明和DOX模型組相比，5~20µg/mL人參皂苷Rg1提高了H9c2細胞活力(圖5A)。Annexin V/PI染色顯示，與DOX模型組比較，5~20µg/mL的人參皂苷Rg1顯著提高細胞活力，降低細胞凋亡(圖5B-D)。此外，全自動細胞成像系統表明5~20µg/mL人參皂苷Rg1的相對細胞數高於DOX模型組，且在24 h時，細胞數增加到約75% (圖5F、G)。因此驗證了人參皂苷Rg1具有減輕細胞凋亡、促進細胞增殖、保護心肌細胞免受DOX損傷的作用。

圖5. 人參皂苷Rg1治療DIC的藥效評價

3.5Rg1-sEVs減輕了DOX誘導的H9c2細胞損傷

為構建sEVs的藥物遞送系統，採用高效液相色譜法對電穿孔法、超聲法和共孵育法三種方法的載藥效率進行了評估。結果表明，電穿孔的載藥率最高，達21% (圖6)。因此後續採用電穿孔法進行藥物包封。

圖6. sEVs藥物遞送平台構建

隨後進行了Rg1-sEVs的藥效評價。CCK-8結果表明，與DOX組相比，Rg1-sEVs的細胞活力顯著提升，且高於單獨的sEVs組和單獨的Rg1組(圖7A)。全自動活細胞成像系統結果表明，在24 h內，Rg1-sEVs和Rg1處理組的H9c2相對細胞數量高於DOX模型組(圖7B)。在24 h時，10 µg/mL的Rg1-sEVs與20 µg/mL的游離Rg1具有相當的心臟保護作用(圖7C)。流式細胞術結果表明，與單獨的sEVs組和單獨的Rg1組相比，10µg/mL的Rg1-sEVs顯著降低凋亡率(圖7D-F)。因此，實驗證明了單獨的sEVs和單獨的Rg1相比，Rg1-sEVs顯示出更好的心臟保護功能，這表明sEVs的藥物遞送在未來臨床應用中具有很好的研究前景。

圖7：MSCs的規模化生產

【Part4 研究結論】

本研究成功地證明了基於生物反應器的3D細胞培養系統可以實現MSC-sEVs的規模化生產，而3D-sEVs可以作為載體遞送人參皂苷Rg1，顯著減輕了DOX誘導的心臟毒性。

與游離的人參皂苷Rg1和sEVs相比，Rg1-sEVs具有更為顯著的心臟保護功能，這提示着3D細胞培養系統在sEVs的規模化生產中具備很好的應用前景。

【Part5 研究團隊】

北京中醫藥大學中醫學院王婧宇副研究員和李春教授為本論文通訊作者，王婧宇副研究員課題組邸雲鳳（2021級碩士）為本論文的第一作者。

【Part6 研究技術支持】

3D TableTrix® 微載體

①更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培養。

②資質全：該產品已取得2項CDE藥用輔料資質，登記號為【F20200000496；F20210000003】，3項FDA原料藥及藥用輔料資質，登記號為【DMF:037798、035481；MF:29721】

③易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。

④更安全：擁有權威组织出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。

⑤易放大：顺利获得3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現百億量級細胞收穫。

3D FloTrix® miniFLEX 4通道生物反應器：

①超薄設計：超薄主機高度僅48mm，扁平化設計可進一步提高培養箱空間利用率。

②不鏽鋼機身：主機採用全不鏽鋼設計，易清潔好擦拭，滿足潔淨需求。

③適配一次性反應瓶：適配韦德国际自研透氣內置葉輪一次性反應瓶。其中，搭配125/250ml透氣內置葉輪一次性反應瓶，可在一台170L培養箱放置2台設備，實現共8個瓶位的培養體系。

④同步關聯：開啟關聯功能，並結合配方工藝的使用，可將多個瓶位統一工藝模式，一鍵操作即可實現多瓶位同步啟動/暫停/停止，高效完成對照試驗。

各瓶位間也可任意關聯操作，如圖示：瓶位1、瓶位2、瓶位3使用工藝一關聯，達到三個瓶位同步運行的效果。

⑤工藝預設：配備十種配方工藝和四種自定義工藝，共計兩類步驟模式，滿足多步驟、多循環工藝需求。

參數可修改，斷電可保存，單步驟時間最高可達1000min,循環次數高達100次，操作便捷。

⑥可編程工藝：攪拌程序可編程、參數自定義。滿足間速模式／雙速模式／間恆速模式不同工藝需求，實現工藝條件的探索和優化。

⑦雙語系統：系統支持中英文雙語，一鍵切換，靈活便捷。

⑧實時信息：系統實時顯示每個瓶位的工藝參數：時間、轉速、工藝、步驟等。

【韦德国际生物】