細胞外囊泡（EVs），包括外泌體和胞吐體，是細胞來源的納米/微米級單層或多層膜結構。EVs含有生物活性貨物，如核酸、脂質、蛋白質和碳水化合物，在細胞間通信中起關鍵作用。EVs的生物活性貨物使其成為各種疾病的有前途的治療劑。此外，EVs的表面介導體內運輸和特定位點遞送，使EVs可以作為小分子和生物藥物的藥物遞送系統。

理想的EVs治療和/或藥物遞送系統應具備以下屬性：i）在給藥前和暴露於生物環境時保持結構/生物分子完整性，ii）靶向遞送，包括器官、細胞和亞細胞水平的特定位點相互作用。對於合成納米顆粒，特定位點遞送通常隨着循環時間的延長而改善。然而，細胞毒性藥物的延長循環可能導致白細胞損傷，造成血液毒性。臨床前研究表明，靜脈注射的EVs在幾分鐘內從血液循環中被清除。EVs在血流中持續存在的必要性尚不清楚。可能EVs由於比臨床批准的合成納米顆粒更複雜的表面，能夠顯示出優越的免疫逃避和靶向特性。在這種情況下，EVs可能需要更短的循環時間即可高效與目標相互作用。

EVs具有與其來源細胞類似的生物活性特性，但與細胞療法相比，具有幾個優勢，包括由於消除了惡性生長和血管阻塞的風險而提高了安全性。此外，EVs的處理和儲存比細胞更容易。已經完成了幾項EVs臨床試驗，更多的試驗正在進行中，以治療各種疾病。令人鼓舞的是，自體和異體EVs試驗均未顯示毒性。此外，臨床上頻繁進行的血漿輸注會導致數萬億EVs的轉移，通常不會導致不良事件，進一步表明異體EVs的生物相容性。動物研究還表明，人類EVs的給藥不會引發（免疫）毒性。

雖然EVs治療和藥物遞送平台在臨床前和臨床研究中顯示出良好的安全性，但EVs的意外免疫原性（除了無免疫毒性）仍然大部分未被探索。該Perspective重點討論不利的免疫相互作用。讀者可以參考其他文獻分析故意誘導EVs免疫原性的研究，如基於EVs的疫苗和免疫治療。

與自體EVs相比，異種和異體EVs可能會顯示出被先天和適應性免疫系統增強清除的現象，尤其是在重複給藥後。在適應性免疫系統的情況下，EVs相關的供體抗原結合到主要組織相容性複合體（MHC）分子上，會觸發免疫反應。值得注意的是，與來源細胞相比，MHC分子在EVs上富集。獨立於適應性免疫系統，單核吞噬細胞系統可以識別異種和異體細胞為外來物質，例如，由於巨噬細胞上自我識別配體-受體對的多態性。先天免疫系統這種立即辨別自體和異種/異體產品的能力是否適用於EVs仍然未知。過去十年的研究還表明，吞噬細胞可以對外來生物分子產生免疫記憶，這被認為需要適應性免疫系統的初次刺激。

儘管自體EVs具有較少的免疫清除，但它們面臨相當大的挑戰，如高生產成本和勞動密集型操作。此外，由於個體之間以及健康/疾病狀況中的EVs異質性，自體EVs的治療和藥物遞送效果可能會有很大差異。篩選最佳異體供體並匯集供體EVs可以減少批次間的變異性。因此，異體EVs在降低製造成本、提高批次一致性和確保療效一致性方面具有前景。本文從批判性角度評估了EVs的潛在免疫原性，並討論了減輕EVs不良免疫識別的新興策略，以用於下一代治療和藥物遞送系統。

EVs的免疫原性可能受到多種因素的影響，包括EVs的來源（來源和生物發生）、大小、內源/外源內容物、生產和儲存方法、劑量、輸注速度以及生物分子冠。

一般來說，移植的細胞只有在與受體基因和表觀基因完全一致時才能成功逃避免疫識別。然而，取得這種一致性常常是具有挑戰性的。幹細胞（如胚胎幹細胞、間充質基質細胞（MSCs）和脂肪來源的幹細胞）具有低免疫原性，能夠釋放在細胞間通信和抑制免疫反應中起關鍵作用的EVs。癌細胞也能逃避免疫監視，其衍生的EVs可以維持免疫逃避特性並促進免疫抑制環境的形成。理解這些相互作用對設計具有免疫逃避特性的治療EVs具有重要意義。

EVs涵蓋廣泛尺寸，不同類型的EVs顯示出不同的尺寸特性。外泌體（30-200 nm）、胞吐體（0.1-1 µm）和凋亡小體（1-5 µm）在大小上有所重疊，影響其與免疫細胞的相互作用。小型EVs在腫瘤和炎症組織中顯示出更好的遞送效果，而較大尺寸的EVs在特定器官中顯示不同的積累模式。尺寸和清除率與靶細胞攝取率的平衡是開發有效EVs治療和藥物遞送系統的關鍵。

特定的表面組分可以作為免疫系統的偽裝，而其他組分則加速免疫識別。EV表面蛋白（如四跨膜蛋白、凝集素和整合素）顺利获得配體-受體機制在免疫細胞相互作用中發揮關鍵作用。工程技術的興起使得在EV膜表面偶聯或表達多種「不要吃我」信號分子（如CD47、CD55、CD59和CD200）成為可能，以克服吞噬清除。现在研究最廣泛的「不要吃我」受體是巨噬細胞上的信號調節蛋白α（SIRPα），它特異性識別廣泛表達的跨膜蛋白CD47。CD47與巨噬細胞上的SIRPα結合，抑制巨噬細胞介導的吞噬作用。CD47存在於各種EVs上，減少了單核吞噬細胞系統的清除。

此外，EVs的高效遞送還需要逃避其他免疫細胞（包括自然殺傷細胞和T細胞）的識別。MHC-I分子在所有有核細胞表面廣泛表達，在呈遞內源性抗原中起關鍵作用。在EVs的生產過程中，MHC-I分子不可避免地被整合到囊泡膜中。基因編輯技術使得選擇性靶向敲除beta2-微球蛋白（B2M）基因成為可能，從而有效降低MHC-I分子的表達，使得這種EVs的免疫原性顯著低於含有完整MHC-I分子的EVs。

非經典的MHC-I分子（如MHC-E、MHC-F和MHC-G）可以抑制NK細胞的活性。在癌細胞的背景下，MHC-G的異常表達使得釋放含有MHC-G的EVs，從而促進宿主內免疫耐受的建立。免疫檢查點分子如程序性死亡配體1（PD-L1）可以抑制T淋巴細胞的功能。在MSCs來源的EVs表面增加PD-L1的表達對T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表現出免疫抑制作用。

EV膜上的糖類和脂質也是重要的信號分子，影響EVs的免疫原性。EVs的外膜表面具有豐富的糖類，其糖綴合物譜在影響細胞攝取和生物分佈中起關鍵作用。脂質在細胞間通信和免疫調節中也起到持续作用。例如，癌細胞來源的EVs中的脂質可以產生免疫調節效應，包括代謝重塑和免疫細胞信號通路的調節。

選擇適當的工程方法對於實現EVs表面生物分子的最佳表達至關重要。常見的工程技術包括基因工程、化學工程和膜雜交。基因工程顺利获得表達載體（如質粒或慢病毒）將重組DNA轉染到宿主細胞中，從而實現所需蛋白的表達。化學工程技術可以分為非共價和共價修飾。EV膜雜交（融合）顺利获得物理擠壓、超聲波和電穿孔等方法將EV細胞膜與人工膜結合。常見的EV標記方法包括熒光、發光和放射性標記，但這些方法可能影響EVs的功能和免疫原性。

除了EVs的表面組分，內源和外源的內部貨物也能顯示免疫調節效果。例如，腦膠質瘤中高表達的環狀RNA circNEIL3被包裹在EVs中並被巨噬細胞吞噬，導致免疫抑制表型。多種EV工程方法可用於在EVs內部加載外源貨物，但這些方法可能影響EV的特性和免疫原性。間接加載是將源細胞暴露於貨物中，儘管加載效率有限。直接加載內部貨物的方法包括超聲波、擠壓、孔形成劑和反覆凍融循環，這些方法可以暫時在膜上創建開口。然而，研究表明，超聲波和擠壓可能降低EVs攜帶的酶的活性，可能導致內源生物分子的損傷或喪失。

此外，可以顺利获得基因工程使源細胞表達蛋白或RNA，並將其加載到EVs內部。與物理和化學加載方法相比，基因工程對EVs的結構完整性影響較小。顺利获得將所需生物分子與EV內部蛋白融合，可以提高加載效率。基因工程技術還被用於賦予EVs免疫調節特性。例如，顺利获得基因工程取得的載有CC16蛋白的EVs在急性肺炎小鼠模型中顺利获得調節巨噬細胞和中性粒細胞展示了抗炎效果。

生產和儲存方法可能導致不同程度的EV損傷，從而影響其免疫原性。例如，源細胞的狀態可能影響EVs的免疫原性。細胞應激會顺利获得應激誘導途徑釋放含有特定免疫調節介質的EVs。分離方法（如超速離心和死端過濾）可能導致EVs聚集、膜損傷和生物分子損傷，可能引發免疫反應。細胞暴露的細胞內生物分子可觸發免疫反應，但尚不清楚暴露的內部EV貨物是否有類似效果。切向流過濾可作為一種溫和的EV分離方法（控制剪切率），以減少EV損傷，從而減輕其免疫原性。

工程改造EVs以攜帶靶向、成像和治療劑可能引起EV損傷，這些成分也可能引發免疫反應。EV樣本中污染物的程度也可能影響免疫反應。例如，最近發現透明質酸（其對免疫系統的影響取決於分子量）是EV樣本中的污染物，並且其水平因EV分離方法而異。超速離心和沉澱試劑盒會導致大量蛋白質污染物的共沉澱，而所有基於尺寸的EV分離方法都會保留蛋白質聚集物，這可能影響劑量準確性或錯誤歸因於EVs的免疫調節效果。密度梯度超速離心可用於提高EV樣本的純度。

在臨床實踐中，即時使用新鮮製備的EVs通常不可行，因此儲存成為臨床轉化EV治療和藥物遞送系統的關鍵考慮因素。通常，EVs可以在4°C下短期儲存（<48小時），而長期儲存需要−80°C條件。然而，儲存後EVs的效力通常會下降。反覆凍融循環和長時間儲存會導致EV融合或聚集，增加粒徑並降低效力。缺乏冷凍保護劑會影響EVs的完整性，從而影響其免疫原性。

EVs的劑量和給藥途徑是影響其免疫原性的關鍵因素。不同的給藥途徑（如靜脈注射、腹腔注射和皮下注射）會導致不同的生物分佈和免疫細胞暴露模式。在小鼠模型中，靜脈注射的EVs迅速積累在肝臟和脾臟，並在肺和腎中也有分佈。腹腔注射的EVs在脂肪組織中的吸收優於靜脈注射，而皮下和腹腔注射則增加了胃腸道和胰腺的EV吸收。

靜脈輸注的治療和藥物遞送系統在臨床轉化中面臨補體介導的輸注反應的挑戰。例如，抗聚乙二醇（PEG）抗體與PEG化納米粒子的相互作用可能引發補體反應，導致過敏性休克。各種治療方法可引起輸注反應，通常在輸注開始幾分鐘內出現。預先用藥和降低輸注速率可以緩解這種反應。雖然EVs可能也會出現輸注速率反應，但由於該領域處於早期臨床開發階段，且主要依賴齧齒動物數據，现在缺乏證據。

合成納米粒子和EVs在生物環境中被吸附的生物分子層包圍，稱為生物分子冠層。冠層的組成影響EVs的生物身份，包括免疫識別和清除。血液循環中的調理素（如補體蛋白、免疫球蛋白和凝血因子）在介導納米粒子和EVs被先天免疫細胞攝取中起重要作用。補體蛋白H在肝細胞癌EVs中豐富，抑制其他補體蛋白的激活，促進腫瘤進展。減少EV模擬物的膽固醇含量可減少補體吸附。EVs的脂蛋白也影響其與免疫細胞的相互作用。核酸（DNA、RNA）是EV生物分子冠層的重要組成部分，影響免疫調節。修改EV表面可以改變冠層組成和免疫識別。去除供體液體中的生物分子冠層可能影響EVs的免疫原性。未來研究應確定有助於形成理想生物分子冠層的EV工程策略。

EV治療和藥物遞送系統迅速开展的領域需要理解不期望的免疫原性，這對於開發安全高效的臨床產品至關重要。這些努力需要免疫學、細胞生物學和納米醫學的跨學科合作。儘管幾項關於EV的臨床前和早期臨床試驗表明其顯著缺乏免疫毒性，但免疫清除仍然很少被探索，特別是在大型動物模型中。可能導致EV免疫原性的因素包括來源、大小、表面組成、內部內容物、生產/儲存方法、劑量、輸注速率和生物分子冠層。理解這些因素對EV免疫原性的影響有潛力為未來開發最佳的EV治療和藥物遞送系統给予信息。已經在探索各種調節EV免疫識別和清除的策略，包括添加和去除EV表面成分。未來的緩解策略可能依賴於改進的EV生產和儲存方法結合工程化的免疫逃避表面。已經確定EV表面上的幾種生物分子具有免疫刺激或免疫逃避特性。未來，組學技術（蛋白組學、糖組學、脂質組學、轉錄組學和代謝組學）結合功能研究，將對於全面識別和實施同時保留特定靶向能力的免疫逃避EV表面至關重要。