【前言 】

幹細胞是一類具有不同分化潛能，並在非分化狀態下自我更新的細胞。幹細胞治療是指應用人自體或異體來源的幹細胞經體外操作後輸入（或植入）人體，用於疾病治療的過程。幹細胞治療被認為是未來醫療的支柱。幹細胞產品真正走向產業化、商業化環節，所面臨的巨大挑戰，其中關鍵的瓶頸問題是幹細胞的高質量和規模化生產。

2023年9月，我國首個人源幹細胞國家標準《生物樣本庫多能幹細胞管理技術規範》（GB/T42466-2023）發佈，在質量控制這一節，提到幹細胞的驗收標準可參考T/CSCB-0002與T/CSCB-0005的內容，其中影響質量的重要因素有細胞來源，細胞活率，細胞生長活性等。幹細胞產品的質量特性一般在細胞培養階段形成。因此，細胞製備工藝對細胞質量、活性等具有重要影響。工藝開發過程中應嚴格選擇合適的培養體系（細胞來源、培養基和添加因子）、培養方式，準確控制培養時間和培養代次等。

【Part 1——培養體系】

細胞的來源是影響其質量的首要因素之一。不同的細胞來源可能會影響其遺傳特性、穩定性以及功能表達。因此，在選擇幹細胞時，必須考慮其來源的質量和適用性，以確保所選細胞具有良好的治療潛力。

圖1. 不同年齡組細胞生長活力對比

Stem Cells Int. 2019 Aug 1;2019:5197983

幹細胞的生物學效力和增殖特性，會隨着傳代次數的增加逐漸下降。研究指出，細胞傳代不宜低於3代。從各代幹細胞生長曲線檢測結果表明，P4-P7代的數據都在高活性範圍之內。就間充質幹細胞（MSCs）而言，臨床應用的最佳代次應在4-8代，因此細胞代次的選擇對於製備工藝也是重要影響因素之一。

圖2：不同代次hUCMSCs的增殖活性檢測以及表面標記表達

Chinese Journal of Tissue Engineering Research,

2017, 21(13): 2015-2022 

對於細胞的培養，培養基類型的選擇，也是幹細胞生產過程中需要考慮的關鍵問題。用於幹細胞培養應採用成分明確、無動物源成分的GMP級培養基。若生產過程中使用非人類來源的成分，如胎牛血清（FBS）。這些動物源成分對人體有潛在危害，可能引起不必要的免疫反應，導致朊病毒和傳染病的傳播。

圖3：3D FloTrix® 間充質幹細胞無血清培養基

（點擊圖片，分析詳情）

【Part 2——培養方式】

細胞培養作為生物醫學研究和藥物開發的重要工具，已經廣泛應用於科學研究、藥物篩選、組織工程等領域。现在幹細胞培養方式有二維培養和三維培養兩種。

圖4：二維和三維細胞培養模式圖

Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(8): 1140-115

二維培養

二維（2D）平面培養是傳統的細胞培養方法，細胞貼附在普通的玻璃或塑料材質的培養瓶表面，沿着二維平面延伸生長，通常呈現出扁平的單層狀態。細胞-細胞相互作用受限，僅限於水平方向。

三維培養

三維（3D）細胞培養是近年來开展起來的一種模擬體內三維生長環境的細胞培養方式。將細胞與三維結構的支架材料（例如微載體）共同培養，構成三維的細胞&載體複合物，使其在三維立體空間生長、增殖和遷移。3D培養更真實地再現了細胞與細胞之間以及細胞與胞外基質之間地相互作用，更準確地模擬細胞在組織中的實際微環境。且三維培養方式更易於規模化生產，可實現產業化。

现在幹細胞規模化生產中，集中於攪拌槽生物反應器、中空纖維生物反應器等培養工藝。

中空纖維生物反應器

中空纖維生物反應器一次運行可生產大量幹細胞。但在貼壁細胞培養過程中，無法檢測細胞增殖狀態和質量情況，且收穫過程面臨胰酶消化時間長、細胞收穫效率及質量難以保障的問題。

攪拌槽生物反應器 + 微載體

基於微載體的攪拌槽生物反應器，在生物製藥行業具有較為完善的經驗和放大標準。幹細胞附着在懸浮於攪拌容器中的微載體上。作為幹細胞附着培養介質，選擇合適的微載體是幹細胞培養擴增過程中保證細胞數量和質量的關鍵變量。

圖5. 韦德国际生物全線可降解微載體

微載體不僅要滿足不同類型幹細胞的粘附和增殖要求，還要考慮如何去除微載體。韦德国际生物開發的3D FloTrix® 全封閉自動化生產工藝中採用的自主研發的3D TableTrix® 及3D RecomTrix® 微載體，顺利获得特異性降解技術，可溫和收穫細胞。

且微載體原材料選用藥用輔料級別並完成了第三方質量檢測及安全性評價，同時已取得2項CDE藥用輔料資質（F20200000496；F20210000003），3項FDA原料藥及藥用輔料資質（DMF：037798、035481；MF：29721），在保證安全性情況下進行細胞收穫，且收穫的細胞滿足幹細胞的基本生物學質量要求。

【Part 3——培養工藝】

傳統人工培養既費時又費力，已逐漸被淘汰。幹細胞治療產品製備過程中，建議採用全封閉的或半封閉的自動化製備工藝，儘可能使用專用的、產品特定的或一次性使用的裝置，以減少污染和交叉污染的風險。培養過程建議採用陆续在的製備工藝，如果生產過程中有不陆续在生產的情況時，應對細胞的保存條件和時長進行研究與驗證。建立規範的全封閉自動化工藝操作步驟、工藝控制參數、內控指標等，對生產的全過程進行監控，以確保幹細胞質量和安全性。整個培養工藝減少人工操作，儘可能實現全封閉自動化，減少污染或交叉污染的風險。

圖6. 韦德国际生物【百億細胞】智造工藝

細胞的活率和生長活性是評估幹細胞質量的重要指標。當幹細胞回輸到體內，只有活着的幹細胞能真正起到修復或治療的作用，失活細胞不僅有礙有效性，還可能會引發機體毒性反應。所以細胞活率不但關乎細胞質量，更涉及人體自身的安全。因此，國內監管對於幹細胞產品的活率要求較高，通常要求新鮮細胞製劑的活率不低於90%，而凍存細胞製劑的活率則不低於70%。因此，在全封閉、自動化、規模化生產工藝上要嚴格控制其培養條件（溫度、溶氧、pH和CO2等）、培養時間、收穫方式等環節，儘量減少對細胞活率的影響。另外，在生產關鍵節點，對樣品的有關檢項，如無菌、內毒素、支原體、內外源病毒等均應符合要求。

【總結】

幹細胞產品類型多樣，不同幹細胞類型，其製備工藝的內容和流程也有所不同，應儘量遵循藥品生產工藝的一般規律，應用質量源於設計的理念，關注製備工藝與產品質量的關係。穩定的規模化幹細胞製備工藝可以保證幹細胞治療產品的質量穩定性，有助於確保臨床試驗結果的一致性。

【韦德国际生物】