傳統的MSC培養模式是2D貼壁培養，這在商業化生產中存在着一定的規模化生產局限性，特別是細胞數量要求達到109 以上時。此外2D貼壁培養中pH、DO等可控性較差，還需要頻繁的傳代消化以擴大製備規模，也會出現批次間差異大、頻繁開口操作增加風險及質控難等問題。而3D微載體培養工藝可以有效地解決上述問題。微載體能夠使貼壁依賴生長的MSC實現動態的懸浮培養，環境更為複雜，因此需要研究者調節和優化工藝參數，維持良好的細胞生長環境，促進細胞貼壁，遷移和生長。

今天韦德国际總結出一些實際培養過程中可供研究者優化的3D微載體培養工藝參數，希望能為大家提供有效的參考與解決辦法。

圖1：3D FloTrix® 間充質幹細胞無血清培養基

DMEM+血清是傳統的MSC培養方式，但是血清是動物源成分，可能引入病原體（如病毒、朊病毒），也存在動物倫理問題，影響臨床應用的合規性，且血清批次間差異大、來源及成分不穩定，實驗重複性差，很難滿足生產及報藥需求。無血清培養基（SFM）或成分限定培養基（CDM），無動物源成分，降低病原體風險，符合臨床（如FDA/EMA）監管要求，也能夠匹配收集外泌體的需求，在製備過程中減少外源外泌體的干擾。

此外，培養基篩選測試也是必不可少的，在常規進行2D培養方式篩選同時，建議同步可以使用非TC處理的培養容器（如T瓶、6孔板）、3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反應器或3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反應器進行靜態或動態的微載體培養篩選。

     圖2：3D FloTrix® microSPIN 6通道微型生物反應器      圖3：3D FloTrix® miniSPIN FLEX 4通道生物反應器

【微載體的推薦使用量是多少？】

圖4：3D微載體溶脹

一般來說，韦德国际推薦的微載體培養密度為1-5g/L，而接種時可適當增加微載體密度，通過細胞貼壁後再補液調整至合適的培養密度。如載體投入量大，建議提前溶脹載體，以保證後續的接種效果。

【細胞接種量多少？】

圖5：模擬細胞貼附於3D微載體

常規MSC接種密度在1-10×104細胞/mg。貼附率是決定後續細胞擴增的關鍵指標，接種密度過高或者過低都有可能影響細胞的貼附，從而影響後續的擴增，並造成微載體或細胞種子液的浪費，可通過優化接種梯度來評估合適細胞接種量。如有高密度灌流培養需求，可提高微載體投入量及細胞接種量並進行充分的優化實驗最終評估細胞貼附率及較高的增值倍數與最終細胞量。

【轉速如何設置？】

轉瓶或者罐體當中以能使微載體全部懸浮起來且攪拌均勻為基準，後期細胞密度上來後，可根據微載體聚集情況微微提高轉速。轉速的設定值既要考慮剪切力損傷，又要考慮好的混合效果，保證細胞培養傳質需求及培養環境的一致性。可以參考雷諾數Re、剪切力shear stress、最小懸浮速率Njs、K length等公式進行綜合評估定性計算。

【接種時如何讓細胞貼附效果更好？】

圖6：細胞貼附狀態

為了使細胞在微載體上有更好的貼附效果，可採用間歇攪拌—靜置—攪拌的方式使MSC在最初的階段粘附在微載體表面，必要時可以延長靜置的時間，或採用低速的攪拌進行接種，以提高貼附效果。

【收穫細胞階段，裂解完仍然有「絮狀物」/「顆粒物」，是否是微載體未裂解完全？】

圖7：3D微載體裂解進程

在收穫細胞時，使用配套的裂解液對微載體進行裂解，將3D微載體裂解為可溶性小分子和短肽。

由於MSC擴增時會分泌細胞外基質（ECM），培養過程中會出現結團的正常情況。而由於裂解液只作用於微載體，不會對細胞和細胞之間的連接（cell-cell interaction）進行消化，因此可能會出現看似聚團物（「絮狀物」/ 「顆粒物」）持續存在的現象。此時可適當延長裂解時間觀察聚團物的變化從而判斷其組成，若持續存在且不變小，則說明微載體全部裂解完全，留下的是細胞團。這些是結團的細胞可以通過後續的離心清洗來使細胞單懸，因此無需繼續延長裂解時長。通過微載體殘留檢測試劑盒對清洗收穫下來的細胞進行檢測可以驗證確認微載體殘留情況，從而證明裂解的時長是否充分。

微載體培養MSC中有較多需要優化和注意的工藝操作點，在實際項目實踐中需要一一攻破。關注韦德国际生物，帶你解鎖更多幹細胞培養相關知識！

【關於韦德国际】

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