引言

在前文中，韦德国际對《細胞組分及衍生物治療新技術臨床研究備案指引（第1版）》（以下簡稱《指引》）的政策背景、核心概念、工藝研究要求及非臨床評價框架進行了系統性解析，並指出該文件標誌着中國外泌體產業正式進入"CMC驅動時代"。（<<點擊查看詳情）

在諸多CMC核心模塊中，質量研究與質量控制體系的建立是最具技術挑戰性、也最能決定企業產品能否最終取得監管認可的關鍵環節。正如《指引》所明確傳遞的監管信號："高顆粒數"不等同於"高質量"，單一技術指標無法支撐醫療級EV產品的放行決策，真正意義上的質量控制必須建立覆蓋鑑別、物理化學性質、效力、純度及安全性的多維度、多層次評估體系。

近年來，隨着國際學術界對EV質量評估方法論的深入探討，2026年由國家藥品監督管理局食品藥品檢定研究院（NIFDC）研究團隊在《Journal of Extracellular Vesicles》發表的綜述性研究——《Quality Evaluation Considerations for Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles-Based Therapeutic Products in China》（Na et al., 2026）——為幹細胞來源EV產品建立了迄今為止最為系統、且與中國監管背景高度結合的質量評估參考框架。值得注意的是，該研究與《指引》第5.5章節"質量研究"所構建的監管框架在核心維度上高度呼應——兩者均要求覆蓋鑑別、純度與雜質、結構完整性、生物學活性與效力以及穩定性等核心質量模塊，且均與ICH質量體系的整體框架保持一致（國家衛生健康委員會，2026；Na et al., 2026）。然而，Na等（2026）的研究在多個關鍵維度上對《指引》的監管要求進行了系統性延伸與深化：從細胞庫管理作為質量控制的邏輯起點，到鑑別策略從通用標誌物向細胞來源特異性標誌物的拓展，再到蛋白冠、膜流動性、致瘤性及免疫原性等《指引》未作詳細展開的新興質控維度，Na等（2026）给予了當前科學認知水平下可操作性最強的技術參考。

本文將以Na等（2026）的研究框架為主要參考，結合《指引》的監管要求及MISEV2023等國際標準，對幹細胞來源外泌體產品的質量控制體系進行深度解析，重點覆蓋幹細胞庫管理、EV鑑別與物理化學表徵、效力測定、純度與膜完整性評估、安全性考量及穩定性研究等核心維度，為行業给予可操作性的技術參考。

註：本文所述質量評估框架不代表正式監管指導意見，而是作為研究者和開發者的參考依據，具體質量標準應根據產品特性、製造工藝及適應症進行科學設計與驗證。

EV質量控制的邏輯起點——幹細胞庫管理

1.1 幹細胞庫分級管理與質控要求

在為EV生產建立細胞庫之前，應對幹細胞的適用性進行全面評估，包括評價細胞的平均EV分泌水平及EV產量在不同傳代次數間的穩定性（Na et al., 2026）。中國幹細胞庫在制度設計上受到《中國藥典》及《用於臨床研究和評價的人幹細胞產品技術指導原則》等監管文件的約束，幹細胞庫須經過細胞鑑別、無菌性、支原體檢測、內外源病毒檢測、生物學功能評價、細胞活性檢測、致瘤性評估以及基因組穩定性等系列檢驗，方可作為EV生產的合規細胞來源（Na et al., 2026）。

Na等（2026）提出，對於經歷遺傳修飾或經廣泛體外傳代的細胞，還須特別關注其可能發生的形態學、表型或遺傳學改變（Yang et al., 2018），並在建立細胞庫過程中召开全面的基因組穩定性評估，包括核型分析、全外顯子組測序（WES）及轉錄組學分析，所檢測的傳代數應不低於EV生產過程所預期達到的最大傳代數（Na et al., 2026）。

對於來自多捐獻者的MSC等幹細胞，是否採用混合捐獻者策略需要審慎權衡。部分研究表明，匯合多捐獻者來源的MSC可降低個體差異，给予功能更一致的細胞譜（Kannan et al., 2024）；然而，也有研究顯示匯合MSC來源EV樣本雖可降低測量變異性，但會掩蓋個體EV亞群的生物學意義（Raj et al., 2012），且更近期的證據表明，匯合多捐獻者幹細胞不能降低批間變異性，反而會模糊差異（Kukaj et al., 2025）。因此，Na等（2026）傾向於強調確保來自有明確細胞來源和可追溯性的單一細胞來源的EV功能一致性，並可採用短串聯重複序列（STR）分型來確認EV的個體細胞來源，排除來自其他捐獻者或人類細胞的污染（Tanudisastro et al., 2024）。

1.2 不同類型幹細胞的特殊質控考量

Na等（2026）特別區分了不同類型幹細胞用於EV生產時的質控重點，對於多能幹細胞（PSC）來源EV，由於自發分化可能導致混入來自不完全分化或非目標分化細胞的EV，這些細胞可能攜帶致瘤因子，需要嚴格鑑別非目標細胞來源EV的比例，並在EV收穫過程中評估並預先確定其比例；對於經基因修飾的工程化幹細胞，需要特別評估修飾是否導致遺傳不穩定性或非預期的細胞功能改變，並顺利获得體外和體內檢測方法評估其腫瘤發生風險。

EV鑑別：通用標誌物到細胞來源特異性標記

2.1 MISEV2023框架下的通用鑑別策略

《指引》第5.5.1章節明確要求同時採用形態學方法和多參數生化檢測對產品進行綜合鑑別：

在形態學層面，透射電子顯微鏡（TEM）是確認細胞外囊泡雙層膜結構的金標準方法；在尺寸分佈檢測層面，納米顆粒跟蹤分析（NTA）、動態光散射（DLS）、可調電阻脈衝傳感（TRPS）和納米流式細胞術（NanoFCM）等多種技術各有其檢測原理和適用範圍，互為補充。

在分子標誌物檢測層面，依據MISEV2023指南（Welsh et al., 2024），EV鑑別通常基於五類蛋白組分進行：跨膜蛋白/GPI錨定蛋白（如四跨膜蛋白家族的CD63、CD9、CD81）、胞質面蛋白（如Flotillin-1、PDCD6IP/Alix）、跨膜蛋白或融合蛋白（如整合素家族）、細胞外基質蛋白，以及用於確認非EV來源的陰性對照蛋白（如內質網蛋白calnexin、線粒體蛋白cytochrome C）。

《指引》要求須同時檢測陽性標誌物（如CD63、CD9、CD81等四跨膜蛋白家族成員）和陰性標誌物（如內質網蛋白calnexin、線粒體蛋白cytochrome C），這一陽性-陰性標誌物組合策略已是MISEV2018確立的國際最低鑑別要求，《指引》在此基礎上予以正式採納（國家衛生健康委員會，2026；Théry et al., 2018）。然而，《指引》所規定的上述通用標誌物策略在Na等（2026）看來存在一定局限性：四跨膜蛋白CD63、CD9、CD81等標誌物在不同細胞類型中高度共享，無法獨立给予關於捐獻者個體身份、細胞類型、組織來源或遺傳修飾狀態等特異性信息，而這類信息對於幹細胞來源EV的治療產品開發至關重要。

針對這一局限，Na等（2026）提出，應根據特定細胞來源和生產工藝建立定向的陽性和陰性標誌物體系。例如，在MSC來源EV的研究中，2024年Nguyen等基於涵蓋五個實驗室、11種不同MSC-EV產品的多重磁珠流式細胞術檢測，鑑定出CD73、CD105和CD44可作為可靠的陽性特異性標誌物，而CD11b、CD14、CD19、CD45及CD79則被推薦為可靠的陰性標誌物（Nguyen et al., 2024）；同年，Chen等（2024）進一步確認PODXL和SSEA4可作為PSC來源EV的特異性陽性標誌物，在超過70%的陽性率下具有良好的特異性。

對於遺傳修飾幹細胞來源EV，還須重點評估EV是否含有遺傳修飾目標，並對EV中遺傳修飾目標陽性的比例進行定量評估（Na et al., 2026）。Na等（2026）同時強調，在缺乏統一的標誌物陽性率標準的背景下，開發者應基於來自同一捐獻者來源或製造工藝的多批次生產數據建立內部檢測標準，並將這些通用標誌物的表達頻率作為產品穩定性的質量控制指標，前提是其與EV產品的功能活性具有可證明的相關性。

2.2 形態學表徵：結構完整性的直接驗證

指引》要求對產品進行粒徑分佈檢測，並推薦NTA等技術作為主要表徵手段（國家衛生健康委員會，2026）。Na等（2026）在此基礎上指出，EV的物理尺寸通常在30至150納米之間，低於傳統光學顯微鏡的衍射極限，因此形態學主要依靠TEM和Cryo-EM進行觀察（Shao et al., 2018）。需要特別關注的是，電子顯微鏡樣品製備過程中的真空條件和脫水步驟往往導致EV呈現典型的"杯狀"形態，這並非EV的真實形態，可能導致誤判（Wu et al., 2015；Jeppesen et al., 2019）；因此，《指引》與Na等（2026）均強調，形態學評估的核心目標應是驗證脂質雙層的存在與完整性，而非單純關注囊泡形狀。

在粒徑分佈規範層面，Na等（2026）對《指引》的要求進行了重要補充：當粒徑分佈與生物學功能之間存在可證明的相關性時，應將特定粒徑範圍內的EV濃度（而非總顆粒數）納入質量標準，並顺利获得正交測量方法結合NTA、TRPS及NanoFCM等不同分析平台以減少各技術固有局限性引入的偏差（Arab et al., 2021）。這一建議具有重要的實踐意義：Na等（2026）基於蛋白質組學研究數據指出，EV內不同粒徑亞群（如大EV，90–120 nm；小EV，60–80 nm）在N-糖基化模式、蛋白組分及核酸含量上均存在顯著差異（Zhang et al., 2018），且有研究發現心臟祖細胞來源的中等粒徑和最小粒徑sEV亞群具有最強的促血管新生和抗纖維化活性，而最大粒徑亞群則不顯示任何功能效應（van de Wakker et al., 2024）。這意味着，粒徑分佈不僅是《指引》所要求的物理化學表徵指標，更可能是與生物學活性直接掛鈎的關鍵質量屬性，有必要在產品開發早期建立粒徑與功能關聯的實驗證據。

Zeta電位、蛋白冠與膜流動性的質量意義

3.1 Zeta電位：穩定性與功能的雙重質量維度

Zeta電位是反映EV膠體穩定性的重要參數，高絕對值的Zeta電位意味着強烈的靜電排斥力，有助於防止聚集、維持膠體穩定性（Midekessa et al., 2020）。Na等（2026）的分析表明，Zeta電位的質量意義已超出單純穩定性範疇，延伸至功能層面：帶正電EV更易與帶負電細胞膜相互作用，促進EV攝取；Zeta電位的變化可能影響EV與靶細胞的結合能力（Dietz et al., 2023）；Zeta電位還可能間接影響EV荷載RNA、蛋白質等分子的裝載效率，進而影響其體內活性（Nakase et al., 2021）。此外，近期研究報道miR-30和miR-155的表達水平與EV的Zeta電位之間存在顯著關聯（Mendivil-Alvarado et al., 2023），提示Zeta電位不僅反映EV的物理化學穩定性，還可能代表與EV生物學功能相關的關鍵質量屬性。

3.2 蛋白冠：被低估的質量控制維度

蛋白冠（protein corona）是指當EV暴露於生物流體（如血漿、細胞培養液）時，流體中的蛋白質吸附至EV表面所形成的蛋白質層（Panico et al., 2022）。Na等（2026）將蛋白冠定位為EV內在特性的重要組成部分，指出其對EV功能具有多方面影響：蛋白冠的成分可改變EV的免疫特性（如增加或降低免疫清除率）、影響EV與靶細胞的識別和內吞效率（Liam-Or et al., 2024）；部分蛋白質可能改變EV的Zeta電位，進而影響其信號傳導、物質運輸及基因表達調控功能（Wolf et al., 2022）；蛋白冠還顺利获得保護EV免受酶解降解而增加其穩定性（Heidarzadeh et al., 2023）。

從質量控制角度看，Na等（2026）指出，部分開發者將EV中最豐富的蛋白質作為批次一致性的指標，但這些蛋白通常在同一細胞培養體系的不同批次中保持穩定，可能掩蓋來自不同細胞來源的蛋白冠批次間變異。鑒於蛋白冠對EV生物學功能的重要影響，Na等（2026）建議在現有科學認知和方法學條件下，應謹慎評估將蛋白冠直接定義為EV的關鍵質量屬性（CQA）的時機，但強調對蛋白冠在產品開發過程中的潛在質量影響應給予充分的關注與研究。

3.3 膜流動性：功能性生物學指標

EV的膜流動性影響其與靶細胞膜的融合能力，進而決定其內容物遞送效率（Verweij et al., 2021）。Na等（2026）指出，EV膜流動性較低時，與靶細胞膜的融合可能不完全，從而降低內含物遞送效率；膜流動性更高的EV通常表現出更強的內含物封裝和遞送能力，特別是對於親脂性小分子，更具適應性；此外，DMSO暴露可導致EV膜流動性改變，進而引起人臍靜脈內皮細胞的細胞毒性（Mizuno et al., 2022）。膜流動性可顺利获得熒光恢復漂白後成像（FRAP）、表面等離子共振或單分子追蹤等技術進行評估（Verweij et al., 2021），是EV質量研究中值得系統納入的功能相關物理化學指標。

綜合以上分析，幹細胞來源EV產品的質量控制體系，在"表徵"維度上已形成從細胞庫管理、鑑別策略到物理化學性質評估的完整邏輯鏈條——細胞庫構建決定了產品的來源可靠性，鑑別體系確認了產品的身份特異性，而粒徑分佈、Zeta電位、蛋白冠及膜流動性等物理化學屬性則共同勾勒出產品的結構與穩定性輪廓。然而，確認"產品是什麼"僅是質量控制的前半段任務；回答"產品能做什麼、有多純、有多安全"，才是最終決定醫療級EV產品能否取得監管認可的核心挑戰。

本文下篇將聚焦效力測定、純度與膜完整性、安全性評估、穩定性研究以及候選CQA框架的系統性構建，深入解析《指引》監管要求與Na等（2026）學術框架在這些關鍵維度上的交匯與延伸，敬請關注！

關於韦德国际

北京韦德国际生物科技有限公司创建於2018年，源於清華大學科技成果轉化，由清華大學生物醫學工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。公司現已开展成為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業及潛在獨角獸企業，並獲國家科技部、工信部等部委多項重點研發專項支持。

作為高質量細胞製造專家，韦德国际生物打造了原創3D細胞智造平台，给予基於3D微載體的定製化、一站式整體解決方案，可實現【千億量級】的細胞藥物及其衍生品的規模化、自動化、智能化、密閉式的生產製備工藝管線。现在，韦德国际生物的產品與服務已廣泛應用於細胞與基因治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發，同時在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）等領域也具有廣泛應用前景。