以下文章來源於外泌體之家（公眾號）

細胞外囊泡（EV）是細胞通訊和生理的重要介質。顺利获得瞬時轉染質粒DNA到靶細胞中，可以產生出特定蛋白質或核酸修飾的EV。然而，DNA轉染試劑複合物（DTC）的大小與EV大致相同，傳統的超離純化可能無法分離這兩種物質，並且DTC產生的活性可能會與EV活性相混淆。來自Codiak BioSciences公司的研究人員發現，差速超速離心（一種常用的EV分離程序）不能將EV與瞬時轉染細胞的細胞培養上清液中的DTC分離。因此，一些研究報告的EV活性可能是由於轉染試劑的污染，而不是EV介導的貨物輸送，這表明了對EV樣品進行嚴格純化和表徵的必要性。相關研究以「Transfection reagent artefact likely accounts for some reports of extracellular vesicle function」為題於10月10日在J Extracell Vesicles雜誌上發表。

圖：Cre轉染後細胞分泌的超速離心顆粒（UCP）中存在的Cre活性不全部來源於EV。（A）將從轉染了Expifectamine的細胞中分離出的UCP分離為四個組分（F1-4）。（B）用抗Cre抗體和EV標記物CD9和CD81對UCP和密度梯度組分進行Western blot分析。（C）蛋白質印跡密度法定量Cre蛋白（i）。（ii）用50μM氯喹和UCP或F1-4處理3天後，顺利获得流式細胞儀分析GFP+報告細胞的定量。（D-F）瓊脂糖凝膠用DNA染料染色，顯示樣本的PCR擴增。（G）用50μM氯喹和UCP或F1-4處理的GFP+報告細胞的定量。對於無細胞條件，在Cre質粒瞬時轉染中沒有細胞的情況下，進行模擬轉染。

細胞外囊泡（EV）是由迄今為止被檢測的所有細胞釋放，與多種生理和病理過程有關。EV可以顺利获得EV表面分子（蛋白質、聚糖或脂類）與受體細胞表面受體的相互作用，或顺利获得向受體細胞輸送貨物來介導其對受體細胞的影響。雖然EV貨物運輸的確切機制尚不清楚，但利用EV自帶的天然通信網絡對於開發EV療法具有特別重要的意義。

近年來，許多研究已經證明EV能夠運送多種貨物，包括DNA、RNA和蛋白質。然而，不同研究中的EV傳送效率和程度差異很大，可能是由於EV來源、生產方法、分離方法和所用報告系統的不同。特別是，關於EV傳遞核苷酸能力的報道差異很大，一些報道稱EV介導的RNA敲除功能很強大，而另一些報道稱沒有可識別的功能傳遞。類似地，報道的蛋白質傳遞效率範圍不確定，從高水平Cre到低水平傳遞Cre、Cas9和薑黃素都有。在許多情況下，研究報告的EV的作用不大，這可能需要更靈敏的報告系統來檢測。然而，這些報告系統的敏感性可能使其容易受到人為因素的影響，重要的是要確保包括適當的控制，以排除非EV來源的物質的干擾。

最近有研究報道稱，顺利获得裝載Cre重組酶的EV用於編輯一個報告細胞系，並且在增強DNA轉染試劑複合物的內體途徑逃逸藥物（如氯喹）的存在下，這種基因編輯活性顯著增加。研究人員顺利获得以下相同的程序複製了這一發現：用EV靶向的Cre去轉染細胞，然後顺利获得差速超速離心純化該細胞分泌的EV，並用再重懸的超速離心顆粒（UCP）處理報告細胞。雖然研究人員能夠檢測到含有EV的UCP樣本中的Cre活性，但也觀察到Cre蛋白水平與Cre活性水平並不相關，這與之前其他課題組觀察到的情況類似。

因此研究人員認為，當使用瞬時轉染並進行標準的EV純化時，EV在報告細胞的基因編輯中實際上是可有可無的；相反，Cre活性是由於DNA轉染試劑複合物（DTC）與UCP中的EV共同純化出來而造成的。研究數據證明，EV靶向的Cre重組酶的生物活性是由於質粒DNA的污染，而不是EV介導的Cre蛋白傳遞。儘管DTC在電荷和密度方面與EV在生物物理學上有所不同，但它們在大小上相似，因此某些純化方法（如差速超速離心）不太可能分離這兩種類型。通常採取的從EV樣本中去除質粒DNA的步驟是介質交換和核酸酶處理，但在這種情形下是無效的。由於這些細胞分析中質粒DNA的有害性質，因此一些關於EV功能的研究可能是DTC污染樣本產生的功能。EV和DTC可以顺利获得密度梯度超速離心分離，這突出了在使用EV生產時，如果顺利获得瞬時轉染來檢測EV功能時，一定要確保消除DTC。

參考文獻： Transfection reagent artefact likely accounts for some reports of extracellular vesicle function. J Extracell Vesicles. 2022;11(10):e12253.

【韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞「智造」平台，给予基於3D微載體的細胞規模化定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物核心產品3D TableTrix®微載片（微載體），是自主創新型、首款可用於細胞藥物開發的藥用輔料級微載體。已顺利获得中檢院等相關權威组织的檢驗報告，並取得2項國家藥監局藥用輔料資質（CDE審批登記號：F20210000003、F20200000496）。同時，產品取得美國FDA DMF藥用輔料資質（DMF：35481）。

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

公司擁有5000餘平米的研發與轉化平台，其中包括1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台；還擁有4000平米的GMP生產平台，並新建1200L微載體生產線。相關技術已取得100餘項專利成果，30餘篇國際期刊報道。核心技術項目已取得多項國家級立項支持與應用。