【前言】

矽肺是由於長期吸入高濃度的游離二氧化矽引起的，是中國死亡率和發病率最高的一種塵肺病。儘管矽肺有明確的病因，但其發病機制複雜，现在尚無有效的治療方法。因此，迫切需要找到一種可能有效的治療方法。

矽肺的特點是矽結節和肺纖維化（PF）。PF的特點是肺實質的破壞，細胞外基質（ECM）的沉積，以及纖維細胞和肺泡上皮細胞表型的巨大變化。成纖維細胞的激活被認為是驅動PF纖維化進展的主要因素，抑制成纖維細胞的激活也可以影響各種治療策略的效果。

而外泌體是由細胞內多泡體(multivesicular body，MVB) 與細胞膜融合後，釋放到ECM中的膜性囊泡，大小為40-150nm。多種類型細胞均可以分泌外泌體，這些外泌體將功能蛋白、mRNA和/或microRNA（miRNA）轉移到受體細胞。外泌體介導的物質轉移已被認為是細胞間研讨的一個重要途徑。

最近的研究表明：間充質幹細胞可以分泌外泌體來修復PF。以往研究中也發現：來自三維培養的臍帶間充質幹細胞外泌體（hucMSCs-Exos）可以改善矽誘導的小鼠PF模型的PF水平。

原文連結：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651322001427

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【Part1—外泌體製備及評估】

本實驗旨在評估hucMSC-Exos對成纖維細胞激活的影響，對照組採用來自MRC-5的外泌體（MRC-5-Exos），兩種外泌體均基於三維動態培養方法取得（圖1：A/B），並進行了TEM（圖1：C/F）、NTA（圖1：D/G）、標誌物的檢測（圖1：E/H）。

圖1.細胞的三維培養和外泌體的鑑定

▌A: 3D FloTrix® miniSpin生物反應器

▌B: hucMSCs和MRC-5細胞的3D培養。

▌C/F：用TEM捕捉外泌體的圖像。

▌D/G：顺利获得NTA，平均顆粒的大小分別顯示為123.9和133.5納米。

▌E/H：顺利获得Western印跡檢測到CD81、CD63和TSG101在外泌體中的表達，Calnexin（一種陰性標記）在外泌體中的表達量很小；然而，顺利获得Western印跡檢測，它在hucMSCs和MRC-5細胞中的表達量相對較高。

【Part2—外泌體治療方法及檢測指標】

為了比較激活成纖維細胞和PF的抑制作用，韦德国际在小鼠的矽肺模型中進行了研究，用hucMSC-Exos或MRC-5-Exos治療30天。

當成纖維細胞被激活並轉化為肌成纖維細胞時，細胞會分泌過多的細胞外基質蛋白，以及α-平滑肌作用（α-SMA）、膠原蛋白I和纖連蛋白（FN）的表達，這可以作為肌成纖維細胞存在的指標，所以韦德国际檢測了小鼠肺部的α-SMA、膠原蛋白I和FN的蛋白表達水平。

【Part3—結果】

3.1 與對照組相比，hucMSCExos處理後，二氧化矽增加的HYP和α-SMA、I型膠原和FN水平的蛋白表達明顯降低。說明，hucMSC-Exos具有抑制小鼠成纖維細胞的活化和減輕二氧化矽誘導的小鼠PF的潛在作用（圖2）

3.2 使用免疫熒光染色確定hucMSC-Exos或MRC-5-Exos均可被小鼠胚胎成纖維細胞（NIH-3T3）細胞內化（圖2）

圖2. HucMSC-Exos抑制成纖維細胞活化以緩解矽誘導的小鼠PF的作用

▌A: 在hucMSC-Exos或MRC-5-Exos治療後，小鼠注入二氧化矽的實驗過程。

▌B: 小鼠肺的H&E和Masson染色（200×和400×）。

▌C: Masson染色陽性膠原纖維的百分比。

▌D: HYP的含量。

▌EF：採用Westernblot法檢測四組小鼠I型膠原和FN型膠原沉積標誌物的表達。數據以每組的平均值± SD，n = 3表示。* P < 0.05（與對照組相比），# P < 0.05（與二氧化矽組相比）。

3.3 與對照組相比，矽組α-SMA、I型膠原和FN表達上調；而矽hucMSC-+組（矽+MRC-5-Exos組）α-SMA、I和FN型膠原水平較矽組降低。說明，hucMSC-Exos抑制了二氧化矽對NIH-3T3細胞中誘導的成纖維細胞的活化（圖3）

圖3.HucMSC-Exos抑制了成纖維細胞的活化

▌A/B：在體外跟蹤hucMSC-Exos或MRC-5-Exos，用Dil紅色熒光染料（Dil：激發=549nm；發射=565nm）來標記hucMSC-Exos或MRC-5-Exos。使用Hoechest藍色熒光染料來標記細胞核。

▌BF：明場。

▌C/D：傷口癒合試驗。

▌E/F：Transwell試驗。

▌G/H：對NIH3T3細胞中α-SMA的免疫熒光染色（綠色）和半定量分析。

▌I/J：顺利获得Western blotting檢測NIH-3T3細胞中hucMSC- Exos的α-SMA、膠原I和FN的表達，每組n=3，* P＜0.05（與對照組相比），# P＜0.05（與二氧化矽組相比）。

3.4 新一代測序技術分析了hucMSCs-Exos和MRC-5-Exos之間不同表達的miRNAs。韦德国际發現miRNA let-7i-5p和TGFβ受體1（TGFBR1）之間的相互作用參與了PF。Let-7i-5p負責激活成纖維細胞，TGFBR1有一個保守的3′與let-7i-5p互補的同源序列（UTR）。因此，韦德国际推測TGFBR1可能作為矽活化成纖維細胞中hucMSC-Exos中let-7i-5p的潛在靶點（圖4）。

圖4. 外泌體-miRNAs的不同表達和基因富集的分析

▌A: 差異miRNA表達的火山圖。

▌B: 差異miRNA表達的熱圖。

▌C: 靶基因預測結果的維恩圖譜。

▌D: 候選靶基因KEGG通路的氣泡圖譜。

▌E: 與纖維化疾病相關的差異miRNA表達。

▌F: 在纖維化疾病小鼠中的差異表達miRNAs（DEmiRNA）的驗證。

▌G: let-7i-5p的候選靶基因。

▌H: TGFBR1 3結合位點示意圖′-UTR到let-7-5p和TGFBR1 3的突變′-UTR。

▌G: 在轉染了let-7i-5p模擬物和TGFBR1 3的細胞中，檢測了TGFBR1的熒光素酶活性′-UTR質粒。數據以平均± SD（n = 3）表示。* P <0.05（與對照組相比）。

3.5 由於TGFBR1與let-7i-5p結合，韦德国际研究了hucMSC-Exos是否干擾了TGFβ 1通路。韦德国际預測hucMSC-Exos介導的let-7i-5p有助於TGFBR1的活性。正如預期的那樣，IHC和Western blotting的結果顯示，小鼠暴露於二氧化矽後，TGFBR1和磷酸化Smad3（P-Smad3）的水平增加，在用hucMSC-Exos處理後，其水平下降，但用MRC-5-Exos處理後，TGFBR1和P-Smad3的水平並沒有改變。說明，TGFBR1/Smad3信號通路與小鼠和NIH-3T3細胞中矽誘導的PF相關（圖5）。

圖5.在小鼠和NIH-3T3細胞中，與矽誘導的PF相關的TGFBR1/Smad3信號通路

▌A-D：採用IHC和免疫印跡法檢測小鼠TGFBR1和P-Smad3水平。

▌E/F：免疫印跡法檢測NIH-3T3細胞中TGFBR1和P-Smad3的水平。所有數據均以平均± SD（n = 3）表示。*P<0.05（與對照組相比）和#P<0.05（與二氧化矽組相比）。

3.6 為了證明let-7i-5p在hucMSC-Exos介導纖維化過程中的調控作用，韦德国际在hucMSCs中使用其抑制劑對let-7i-5p進行基因修飾。熒光素酶報告基因分析表明，let-7i-5p以TGFBR1為靶點。免疫印跡法檢測NIH-3T3細胞中α-SMA、I型膠原、 FN、TGFBR1和PSmad3的水平。結果顯示，與矽+hucMSC-Exos-let-7i-5p抑制劑組相比，矽+hucMSC-Exos-let-7i-5p抑制劑+siRNA TGFBR1組中α-SMA、I型膠原、FN、TGFBR1和P-Smad3蛋白水平降低（P < 0.05）。說明，hucMSC-Exos let-7i-5p顺利获得TGFBR1調控NIH-3T3細胞中P-Smad3的激活，並抑制成纖維細胞的激活（圖6）。

圖6.HucMSC-Exos let-7i-5p顺利获得TGFBR1/Smad3信號通路抑制NIH-3T3細胞中成纖維細胞的激活。

▌A: 不同誘導劑處理let-7i-5p的實驗過程。

▌B: 採用RT-qPCR，檢測let-7i-5p的表達。

▌C/D：採用免疫印跡法，檢測α-SMA、I型膠原、FN、TGFBR1和P-Smad3的相對蛋白水平。*P<0.05（與對照組相比），#P<0.05（與二氧化矽組相比），&P<0.05（與二氧化矽hucMSC-Exos組相比）。

▌E: 不同誘導劑處理TGFBR1或Smad3 siRNA的實驗過程。

▌F/G：採用免疫印跡法，檢測α-SMA、I型膠原、FN、 TGFBR1和P-Smad3的相對蛋白水平。* P < 0.05（與對照組相比），# P < 0.05（與二氧化矽組相比），&：P < 0.05（與二氧化矽hucMSC-Exos組相比），^：P < 0.05（與二氧化矽+ hucMSC-Exos let-7i-5p抑制劑組相比）

▌H/I-hucMSC-Exos let-7i-5p抑制劑組：採用免疫印跡法，檢測α-SMA、I型膠原、FN和P-Smad3的相對蛋白水平。每組n = 3，*P<0.05（與對照組相比），#P<0.05（與二氧化矽組相比）。

【Part4—討論】

外泌體的細胞間轉移是一種成熟的介導細胞間通信的機制，其由質膜分泌並進行自由運輸。一些證據來源支持細胞外miRNA分泌現象，miRNA（和外泌體）的細胞間通信不僅存在於同一生物體的細胞之間，也存在於不同的生物體之間。在研究中，已經證實這些外泌體可以被成纖維細胞吸收。

Let-7是最早發現的miRNA之一，其家族是最大的miRNA家族之一。hucMSC-Exos中的let-7i-5p可能干擾TGF-β信號通路以阻斷纖維化，從而進一步改變它們的基因表達表型和譜。

TGFβ 1是PF最有效和研究最充分的誘導劑之一，它可以激活成纖維細胞，促進ECM的產生。抑制TGFBR1可以預防或減少不同組織的纖維化，從而導致Smad3磷酸化水平降低。在研究中， Smad3在二氧化矽誘導的成纖維細胞的激活中也發揮了重要作用。GFBR1作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶被激活，它可以磷酸化細胞質中的Smad3（P-Smad3）。P-Smad3是Smad3激活的主要形式。在沒有Smad3基因的小鼠中，可以觀察到P-Smad3信號的顯著衰減。TGF-β觸發了Smad3的激活和磷酸化。

【Part5—結論】

綜上所述，二氧化矽暴露誘導小鼠和NIH-3T3細胞中let-7i-5p水平降低，三維培養hucMSC-Exos可顺利获得靶向TGFBR1使let-7i-5p進入成纖維細胞，導致Samd3水平降低。最終減少了由二氧化矽誘導的成纖維細胞的活化。因此，三維培養hucMSC-Exos可顺利获得抑制成纖維細胞的活化，對二氧化矽誘導的PF患者起到持续的治療作用 。

【Part6—研究相關產品】

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【關於韦德国际生物】

北京韦德国际生物科技有限公司由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學的科技成果轉化。公司專注於打造原創3D細胞“智造”平台，给予基於3D微載體的細胞規模化、定製化擴增工藝整體解決方案。

韦德国际生物的產品與服務，可廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

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