【Part 1前言】

研究背景：

各種類型的幹細胞由於其自我更新和多能分化的能力而成為組織工程中最有吸引力的細胞來源，主要可以顺利获得生物材料支架調節幹細胞的活性，進行病變和受損組織的再生或修復。

幹細胞在支架內生長時，會將支架視為它們的微環境，並顺利获得改變它們的行為做出相應的反應。組織工程多採用傳統的大小固定支架和可注射生物材料，由於難以產生宏觀功能組織而受到極大局限。

因此，精確控制支架特性和增加對細胞-材料間相互作用的方法，對於建立基於幹細胞臨床應用的組織工程技術至關重要。

面臨挑戰：

水凝膠因良好的可調性、可精確控制支架特性等對細胞生命活動有重要影響的特點，經常應用於組織工程，是研究細胞-物質相互作用或作為細胞載體促進組織修復時一個很有前途的工具。但在組織工程技術的體內應用中仍面臨諸多挑戰：

1.傳統水凝膠：

在長期培養中往往會增加細胞衰老，或改變幹細胞的「乾性」，或影響分泌旁分泌因子的能力。

2. 自交聯水凝膠：

• 誘導自交聯的方法是基於特定的水凝膠體系，不能廣泛應用於其他水凝膠製品；

• 在凝膠化過程中，對被包裹的細胞造成損傷；並且由於限制了細胞外基質和細胞間相互作用，從而影響凝膠化後的細胞活性；

• 其中，物理交聯會導致水凝膠容易被機械符合破壞；化學交聯可能與被包裹細胞的一定程度的毒性有關。

新的思路

3D微載體：

• 具有良好的生物相容性；

• 較大的比表面積更易於藥物分子相互作用；

• 具有連接外部和內部的孔隙，可以促進營養物質和氧氣和廢物的有效運輸；

• 為細胞给予多孔的微環境，保護細胞免受機械損傷，更好的維持細胞的活性和功能。

顺利获得將間充質幹細胞裝載至3D微載體中形成微組織，並將其放置在3D打印的框架中，培養數天以誘導預組裝成具有一定功能的組織結構。

【Part 2材料與方法】

利用3D打印技術製作網格框架，顺利获得明膠微載體製備、細胞培養、製備裝載MSC的微載體，將其裝載至網狀框架中。

對細胞的活性、凋亡、細胞功能性評估（三系分化、衰老）分泌組學分析、蛋白質組學分析、生物信息學分析以及預組裝結構的宏觀和微觀力學測試。

最終顺利获得進行三組對兔關節軟骨缺損的體內植入動物實驗和體外分析。

圖1. 總體研究設計示意圖

【Part 3結論】

3.1與非預組裝微載體和2D細胞相比，預組裝構建的間充質幹細胞的特徵和功能評價

預組裝結構中生長的MSCs可以維持其幹細胞表型，與非預組裝微載體和2D的MSCs相似，並且能更好維持幹細胞乾性和抑制細胞衰老，顺利获得進行對飢餓培養後細胞上清液進行分泌蛋白組分析，發現預組裝結構培養的MSCs的旁分泌功能（如募集因子、增殖因子、免疫調節因子和血管生長因子）被激活。

圖2. 預組裝構建體中MSC與非預組裝微載體和單層培養相比的表徵和功能評估

3.2不同時間點組裝的3D構建物的MSC特徵和功能分析

D3可以觀察到預組裝結構的形成，D7可呈現預定義的形狀，在D7和D14，移去框架，構建體的結構不變。培養7天內細胞活性相對穩定，在培養至14天，細胞增殖被大大抑制，細胞死亡也顯著增加。隨着培養時間的增加， ECM逐漸增加，並且在D7時因ECM的積累使3D微組織構建體的顯著成熟，给予了滿意的力學性能。

在構建後第7天,MSC的相關標誌物（SOX2、NANOG和OCT4）顯著上調並在D14保持相對穩定，衰老相關標誌物（P16、P21和P53）在預組裝過程開始後的D3就顯著下調。預組裝結構中培養的MSC在D7保持了最佳的乾性並抑制了衰老過程，旁分泌功能隨着時間的推移而增加。

圖3. 在不同時間點預組裝的3D構建體MSCs表徵

3.3裝載MSC的3D微載體預組裝成功能結構的機制

在0、3、7、和14天，顺利获得蛋白質組學特徵分析預組裝構建體的蛋白質，其中有199個高表達蛋白，並且在D14，高表達蛋白數量出現了顯著翻倍變化，如COL4A2和SOD2。高表達的蛋白主要是ECM相關蛋白，如膠原蛋白、纖維連接蛋白和LOXL2，可以為基質成分或細胞表面受體给予結合位點，有助於促進細胞-基質相互作用形成複雜的3D網絡。

圖4. 微組織預組裝成功能構建體的機制

3.4利用預組裝構建體進行體內軟骨修復

顺利获得軟骨缺損修復的宏觀評價、組織學評價、免疫組學分析，發現使用3D構建體修復的軟骨缺陷表面平整，幾乎完全被再生組織填充，新生組織與周圍正常軟骨外觀相似。填充的透明樣軟骨填充，與周圍正常軟骨的組織學特徵相似。其他兩組僅部分修復組織，表面不規則，修復組織質地柔軟且存在明顯的缺陷邊界，以纖維狀和軟骨樣軟骨的混合物進行修復。3D構建組的軟骨修復效果比其他兩組好。

圖5. 使用預組裝構建體進行體內軟骨修復

【Part 4總結】

顺利获得將含有間充質幹細胞的3D微載體來預組裝成的3D功能組織結構，不但在維持MSCs的表型特性和乾性上優勢突出，更在抑制其衰老和增強其旁分泌功能方面也表現出顯著能力。同時，預組裝的機制被證明與ECM積累有關，可加強結構內細胞-ECM的相互作用。

在兔關節軟骨缺損模型中，預組裝的3D構建體顺利获得形成透明狀軟骨顯現出誘導缺損能力較強，在單獨微載體細胞填充和對照組中均未發現，因此預組裝的構建體可以作為替代組織工程植入物來促進組織缺陷的體內修復。

這種開發3D宏觀組織結構的策略允許優化幹細胞功能和構建仿生組織類器官，具有廣泛應用於各種組織和組織工程的潛力。

【Part 5研究相關產品】

3D TableTrix® 微載體

更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生細胞培養。

資質全：

• 2項中國CDE藥用輔料資質，

備案號：F20200000496、F20210000003；

• 3項美國FDA DMF Ⅱ型 & Ⅳ型、MF Ⅱ型資質，

備案號：037798 & 035481、29751。

易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。

更安全：擁有權威组织出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。

易放大：顺利获得3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現百億量級細胞收穫。

【關於韦德国际】

北京韦德国际生物科技有限公司创建於2018年，由清華大學醫學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。核心技術源於清華大學科技成果轉化，並已取得多項國家級立項支持與應用。

作為高質量三維細胞製造專家，韦德国际生物给予基於3D微載體的一站式定製化細胞規模化擴增整體解決方案，打造了原創3D細胞智造平台，實現規模化、自動化、智能化、密閉式的細胞藥物及其衍生品生產製備，以此幫助全球客戶建立最為先進的細胞藥物生產線。在開創【百億量級】幹細胞製備工藝管線後，加速向【千億量級】進發，致力於以3D細胞規模化智造技術賦能細胞與基因治療產業，惠及更多患者。

现在，韦德国际生物的產品與服務，已廣泛應用於基因與細胞治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發。同時，在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）領域也具有廣泛應用前景。

韦德国际生物擁有5000平米的研發與轉化平台，其中包括1000餘平的以3D細胞智造及微組織再生醫學治療產品為核心的CDMO服務平台；以及4000平米的GMP生產平台，並新建了1200L微載體生產線。此外還在上海設有2000餘平的國際合作與技術應用中心，以技術創新持續融入全球生物產業新業態。