小仙云：非常感謝老朋友蔣衛博士的提醒，這篇文章是步步在世的時候的殘稿，小仙把文章重新整理完成後發表，但是參考文獻主要是蔣博士2022年發表Theranostics上的綜述文章，特此更正，也感謝蔣博士及時指正！

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類器官（Organoid），最早定義是顺利获得細胞分離和重聚來模擬器官發生。自2009年，荷蘭科學家Clevers團隊開發小腸類器官以來，類器官的定義變成了由器官特異性細胞組成的三維（3D）結構，其來源於多能幹細胞（PSC）或成人干/祖細胞。

類器官organoid被描述為「體外微型器官」或某種程度上的「人造器官」，可模擬體內器官景觀，展示體內發現的一系列細胞類型，並展示器官功能的某些方面。Organoid技術已經成為一種工具，可彌合細胞和組織/器官水平的生物模型之間的差距，在保留某些生理功能的同時，更真實地描述體內組織的空間組織以及細胞和細胞外環境之間的相互作用。

在過去的十年中，胰島類器官作為一種很有希望的糖尿病模型引起了越來越多的關注，它可以揭示胰島相關疾病的機制，並且是一個測試藥物效力和毒性的良好平台。例如，胰島類器官可以填補韦德国际有關早期（8周妊娠）和晚期妊娠人類胰腺組織（妊娠22周）的人類胰腺發育知識的空白，有望成為糖尿病治療中移植的新胰島資源。

製造人類胰島類器官的細胞

構建胰島類器官，需要胰腺內分泌細胞。適合構建胰島類器官的細胞類型，包括：1）人類多能幹細胞來源的胰島細胞；2）顺利获得去分化和再分化在成人胰島中富集的胰腺內分泌細胞；3）非胰島譜系細胞（如導管、腺泡細胞和肝細胞）。

不同方案製備胰島類器官，在結構和功能上存在顯著差異。同時，輔助細胞（包括內皮細胞和間充質細胞）在胰島類器官形成過程中有促進作用（圖1）。

PSC衍生的胰島細胞系

多能幹細胞（PSC），包括胚胎幹細胞（ESC）和誘導性多能幹細胞（iPSC），都是理想的胰島細胞來源。

從PSC取得β細胞是一種很常見的方法，利用PSC衍生的胰島內分泌細胞製造3D人類胰島類器官。早在2001年，hESC系H9顺利获得懸浮培養中形成了類胚體的形態。在分化19天後，這些類胚體平均有1–3%的胰島素陽性細胞和更複雜的結構（如上皮或內皮樣細胞結構）。隨後，從PSC中提取的胰腺內分泌細胞可以體外培養富集，形成簇狀結構。

人ESC來源的胰島素生成細胞也可以自我聚集成胰島素陽性簇，並顺利获得移植或與人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）混合實現血管化。

除了PSC衍生的內分泌細胞外，內胚層祖細胞也可能是胰島類器官生成的一種有希望的資源，這可能會大大縮短體外培養時間並降低經濟成本。

來自人類胰島或非胰島譜系的胰島內分泌細胞

人類胰島細胞也是胰島類器官的一種細胞來源。在研究中，人類胰島被製成單個細胞，並重新聚集成具有標準尺寸的小胰島類器官，也被稱為假胰島。重新聚集的人類胰島的形態與天然胰島相似，可以改善糖尿病小鼠的糖尿病逆轉。

由於成熟胰島內分泌細胞的增殖能力有限，替代方案可能是製備大量的胰島素生成細胞。在這些研究中，顺利获得擴張成人胰腺組織或從胎兒胰腺消化的胰腺祖細胞成功生成了人類胰島類器官。

此外，來自β細胞去分化的內分泌祖細胞可以分化為NGN3陰性、激素陽性的β（胰島素）、α（胰高血糖素）和δ（生長抑素）類細胞。另一項研究說明了利用仿生支架構建細胞間和細胞-基質連接，以誘導β細胞去分化，從而進行再分化。或者，內胚層來源的分化細胞的反式分化也應用於胰島類器官的生成，例如肝臟、胃腸道上皮和外分泌胰腺細胞。然而，脫分化和再分化的不同培養效率因情況而異，胰島的擴增也存在很多爭議，這限制了從成人組織中提取胰島類器官的开展。因此，人們不断致力於尋找具有向內分泌細胞擴張和分化能力的成年胰島內分泌祖細胞。有報道在成年小鼠胰腺中發現的新的PRORC陽性內分泌祖細胞可以在成年體內平衡期間生成新的內分泌細胞。

在體外，這些PROCR陽性的前體細胞可形成以β細胞為主的功能性胰島類器官，並被α、δ和PP細胞包圍。然而，人類胰島是否包含對應的祖細胞群仍不清楚。與PSC衍生的內分泌細胞相比，利用成人組織中的細胞可以避免移植後形成畸胎瘤的風險，糖尿病患者的胰腺細胞可以成為生成人類胰島類器官的更自然的來源。

胰島類器官的輔助細胞

內皮細胞和間充質細胞等也對胰島的存活和功能起支持作用。胰島有豐富的血管供應，為人類胰島给予充足的氧氣、營養供應、微調血糖傳感和調節。內皮細胞可以產生多種因子，如結締組織生長因子、骨形態發生蛋白2（BMP-2）和BMP-4，可增加人ESC衍生的胰腺祖細胞貼壁培養中胰島素的表達，並介導胰島特異性成熟。例如，HUVEC或內皮細胞已與人類胰腺祖細胞或內分泌βH1β細胞混合，以促進胰島類器官的自我聚集、成熟和血管化[35、39、57]。除了外源性添加內皮細胞外，內皮生長因子還可以誘導人胰島類器官的血管生成。

血管生成素-2已被證明在胰島類器官內誘導VE鈣粘蛋白+內皮細胞和NG2+周細胞的廣泛傳播。此外，血管生成素-2可以部分補充內皮細胞對β細胞的體內旁分泌刺激，顺利获得促進F-肌動蛋白重塑和調節鈣離子內流動力學，使人類胰島類器官具有天然的葡萄糖刺激胰島素分泌水平。

MSC也參與胰島樣類器官的構建，包括自組織、血管網絡的構成和旁分泌功能：

（a）間充質細胞觸發自凝，這種由肌動球蛋白細胞骨架軸產生的牽引力導致細胞群的定向和劇烈運動。

（b） 在肌內人胰島移植模型中，除了觸發自凝聚外，間充質細胞還支持內皮細胞相互作用：人胰島內皮細胞從移植中心遷移到周圍組織，與受體內皮細胞形成嵌合血管；

（c） 據報道來自骨髓的大鼠間充質細胞顺利获得釋放HGF和TGFβ等營養因子，在水凝膠環境中支持包裹的小鼠胰島，葡萄糖激發後胰島素分泌增加。

製造人類胰島類器官的材料

人胰島類器官中的生物材料可以為細胞给予3D結構的支持、細胞外環境（ECM）的模擬以及在移植後的隔離保護。

用於人胰島類器官構建的天然基質

天然基質是細胞外基質（ECM）衍生物或類似物，可模擬體內組織或器官的天然ECM。天然基質分為三大類：多糖材料、蛋白質/肽基材料（如膠原蛋白、明膠、彈性蛋白和纖維蛋白）和脫細胞ECM材料。

多糖材料

多糖材料由於具有快速凝膠特性，適合在體外製造3D支架。

1980年，首次將海藻酸鈉應用於生物人工內分泌胰腺的胰島微囊化。海藻酸鈉可以保護胰島細胞在移植後免受炎症反應的影響。海藻酸鈉還可以顺利获得包裹來源於PSC的胰腺內分泌祖細胞，用於生成人類胰島類器官。缺點是海藻酸鈉細胞粘附和細胞相互作用能力較低，無法给予細胞存活所需的細胞錨定。

2020年，海藻酸鈉和殼聚糖組成的膠囊，用於生成人類胰島類器官。該膠囊具有高度的均一性，顺利获得包封來自iPSC的胰腺內分泌細胞，為人類胰島類器官给予3D培養。基於多糖材料在體外支持3D支架和模擬ECM生成人類胰島類器官方面顯示出巨大潛力。

蛋白質/肽基材料

蛋白質/肽基材料由存在於天然ECM中的基質蛋白製成，包括膠原蛋白、明膠、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白。在這些蛋白質中，膠原蛋白是種類最豐富的結構蛋白，已被廣泛用於三維幹細胞培養。除了為胰島類器官構建人工3D結構外，基於蛋白質的材料還將增強胰島類器官的功能和成熟度。

如I型膠原和IV型膠原的高表達被證明有助於人類胰腺的發育，I型膠原和IV型膠原的結合將導致培養的人類胰島中胰島素基因的表達高於纖維連接蛋白或層粘連蛋白。V型膠原基質的存在促進了人類胰島類器官的再生和葡萄糖反應性激素的產生。

脫細胞ECM材料

脫細胞ECM（dECM）材料從脫細胞組織/器官中取得。dECM材料可以更好地模擬體內組織或器官的生態位。

體內ECM具有組織特異性成分，包括特異性生長因子和大分子成分，以及機械性能。因此基於dECM的材料不僅可以作為支架，可用於在體外培養中確定特定的細胞命運。脫細胞胰腺ECM基材料成為改善胰島細胞微環境的合適基質，並促進人PSC向胰島細胞分化。在胰腺dECM材料上從PSC分化的細胞顯示出與天然胰島相似的細胞組成，並呈現出胰島標誌物表達增加和更多胰島素分泌以響應葡萄糖刺激。

總的來說，dECM的材料為細胞给予了一個近乎自然的微環境，但有幾個限制妨礙了它們的臨床應用：

a）取得dECM凝膠的過程，包括脫細胞、提取和純化，既耗時又昂貴；

b）原材料資源，尤其是生物質資源的批次間可變性；

c）幾乎不可能控制生物物理性質和生化成分；

d）這些凝膠來自可能遭受細胞相容性和病原體傳播的生物體。

用於人類胰島類器官構建的合成基質材料

用於藥物治療的合成基質材料通常具有生物相容性和無毒性，具有可控性、再現性、降解性和良好的機械性能等優良特性。

常見的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）及其衍生物、聚乳酸（PLA）、聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、聚乙烯醇（PVA）、聚己內酯（PCL）。根據具體應用，合成基質可以定製為不同的特性，例如，给予ECM特性以增強體外細胞間的相互作用，並模擬天然胰島的硬度，這使得合成基質成為一種有前途的基質材料。

PCL是一種具有高機械穩定性的生物相容性和生物可降解聚酯，顺利获得將PCL與價格合理、熱穩定性高、親水性強的PVA混合，可以改善其較差的細胞親和性。基於PEG的基質也是一種多功能工具，用於模擬細胞微環境，並為人類胰島類器官给予平台。

與懸浮培養相比，由PEG/膠原蛋白I混合基質製成的3D培養平台對人類胰島類器官具有優勢：

a）能夠長期培養胰島類器官

b）保持聚集大小和形態

c）不會對胰島分化產生不利影響

d）给予聚集恢復的手段。

為了改善合成基質的低細胞-基質相互作用，科學家將天然成分與合成聚合物混合，例如明膠/PLGA和PEG/膠原I基質，它們也被定義為半合成基質材料。

人胰島樣類器官的製備方法

3D培養為類胰島给予一個更真實的環境和結構組織，類似於天然人類胰島。構建的標準方法包括傳統的自聚集法、改良的自聚集法和水凝膠包埋法。還將討論3D生物打印、脫細胞器官支架和晶片上器官等新出現的方法（圖3）。

胰島類器官三維結構的傳統細胞自聚集

細胞自聚集（自組織），是一個分離的細胞可以自組裝成組織樣結構的過程。低粘附性培養材料、輔助細胞和軟基質等因素，均可促進細胞自聚集。

例如，低附着板可以刺激人PSC衍生的游離胰腺祖細胞、內分泌細胞或人β細胞自發聚集成3D胰島樣器官。给予懸浮培養條件的旋轉燒瓶可以誘導胰島類器官的3D結構。將人胚胎幹細胞懸浮在旋轉瓶中形成類胚體，取得3D結構，然後進行逐步的胰島內分泌分化。此外，間充質細胞可以幫助啟動自我聚集，並改善聚集功能。MSCs觸發的自組織胰島樣類器官被放置在3D打印的組織捕捉器中，並植入小鼠體內90天，具有檢測血管、更多胰島素陽性細胞和人類C肽分泌。軟基質也有助於細胞的自聚集。

因此，傳統的體外細胞自聚集可以產生令人印象深刻的類器官微觀和功能複雜性。然而，由於缺乏預先定義的外部模式指示，傳統的細胞自聚集總是會導致聚集維度變化很大的異質類有機物群體，每個聚集體的細胞數量被認為在細胞簇分化和功能性中發揮作用。

胰島類器官三維結構的改良細胞自聚集

確定簇的大小對於人類胰島類器官的生成非常重要。無論是體外培養還是植入，與小尺寸胰島相比，大尺寸胰島都會導致壞死增加和細胞活力降低。小型人類胰島類器官（250個細胞）的細胞胰島素含量比大型同類器官（1500個細胞）高2.8倍。

為了取得同質大小的類有機物，相應地開發了用於某種程度上受控的細胞自聚集的替代方法，例如懸滴、微接觸打印和微孔平台。

懸滴法顺利获得重力形成細胞團，通常用於胚狀體的形成，完全不接觸任何人工支持基質或表面。Montanari及其同事報道顺利获得將單個人類胰島細胞與懸掛的微滴中的MSC混合而生成胰島類器官的方法，這些微滴在體內具有功能性胰島素分泌。顺利获得懸滴，可顺利获得改變細胞懸浮液濃度、液滴體積和培養時間來調節胰島類器官的大小。然而這種方法是勞動密集型的，不適用於大型工程。

Mendelsohn及其同事報告了一種微接觸打印策略，顺利获得在玻璃蓋玻片上打印共價連接的細胞粘附蛋白層粘連蛋白斑點。這項技術给予了對細胞簇形狀和大小的特殊控制，而高速打印使生產β細胞聚集體的高通量方式成為可能。然而，這些細胞簇只有兩到三層細胞，甚至不能從基質上移除。因此，它們也不適用於胰島模型、生物學試驗或植入。

微孔可能是一種有希望的基於自組織的胰島類器官生成方法。微孔由多個微米大小的腔室組成，顺利获得光刻或微圖案化產生，材料範圍廣泛，如聚二甲基矽氧烷（PDMS）、聚乙二醇和瓊脂糖水凝膠。在瓊脂糖微孔平台上，細胞被捕獲並聚集成葡萄糖反應的「假胰島」或大小穩定且均勻的胰島素產生類器官，這提高了移植後胰島細胞的存活率。此外，凹形微孔底部較薄，增強了大鼠胰島球體的透氧性，因為在充足的供氧條件下，胰島球體呈現出長期可持續性、增強的生存能力和增加的激素分泌。經證明，塗有組合ECM蛋白的薄膜微孔陣列支架可促進人類胰島功能和存活率。然而微孔仍然存在局限性，例如細胞聚集體的尺寸範圍狹窄、微孔製備所需的特殊程序以及細胞分佈的低可控性。

此外，儘管帶有懸浮液的自聚集類有機物顯示出極好的營養擴散，但缺乏某些物理化學支持，如自然器官生態位，會降低胰島類有機物的穩定性和細胞活力。

基於水凝膠的人胰島類器官包埋和封裝

除自聚集外，將細胞包埋在水凝膠基質中也是建立胰島類器官三維結構的一種很有前途的方法。在這種方法中，分離的細胞顆粒通常懸浮在聚合物溶液中，直到細胞均勻分佈，然後顺利获得聚合物的交聯形成水凝膠。水凝膠基質為聚集細胞给予初始指導，並作為胰島類器官形成的後續物理支持和約束。

將人類ESC與I型膠原和基質凝膠溶液的混合物包埋，形成初始半徑為8 mm、厚度為2.5mm的3D支架，可建立胰島類器官。在另一份報告中，人類胎兒胰腺組織的小塊被包裹在Matrigel中，並擴展成具有胰島內分泌命運的類器官。

將細胞包埋在水凝膠中建立的胰島類器官不僅可以形成胰島細胞的三維結構，给予模擬胰島自然生態位的細胞-細胞外基質相互作用，而且有助於其長期存活。為了維持移植後胰島在體內的可持續性，「胰島包裹」可能是一個很好的策略。包封方法就像一個膠囊，由被基質材料包圍的胰島組成。

Stock及其同事用聚乙二醇-馬來酰亞胺（PEG-MAL）與二硫代PEG（SH-PEG-SH）交聯製成的保形塗層，並輔以PepGel肽和PEG低聚乙硫醚（PEG-OES）納米纖維，將源自人類幹細胞的類胰島有機物包裹起來。在這項研究中，胰島樣類器官在體外與未包封的胰島保持相當的胰島素分泌曲線和刺激指數長達7天，甚至可以防止在海藻酸鈉和聚乙二醇-海藻酸鈉較大微囊中包封的胰島中可見的中央壞死。此外，將胰島類器官移植到糖尿病小鼠體內，使糖尿病得以長期逆轉，並在沒有免疫抑制的情況下維持正常血糖80天以上。

但這種封裝應用仍存在一些局限性:由於封裝的胰島較小，植入的膠囊無法固定在精確的位置，也不容易從患者身上完全取出；當包封在更大的配置中時，存在擴散問題，導致氧氣擴散不良，嚴重損害胰島的生存能力；封裝後胰島的壽命和擴展性仍不足以滿足後續醫學應用。

人胰島類器官的三維生物打印

顺利获得3D生物打印技術構建人體類器官受到了特別關注。顺利获得模仿器官的自然異質結構，類器官形成有望在所需位置定位不同類型的細胞，或在特定位置誘導祖細胞成為所需類型，如打印。3D生物打印技術能夠以高精度和可重複性將所有組件打印和模式化為3D結構，包括空間分佈的細胞、生物材料（bioink）和生物活性因子。因此，3D生物打印给予了構建類器官的理想策略。

在胰島方面，顺利获得3D打印，PLA和纖維蛋白水凝膠被用於容納人PSC衍生的β細胞簇。在移植到小鼠體內後，SC-β細胞嵌入3D打印設備可運行12周，可回收，並保持結構完整性。Duin及其同事顺利获得3D擠壓生物打印技術製作了具有嵌入大鼠胰島的大孔水凝膠結構。這種大孔結構可以增加表面與體積的比率，並將胰島與周圍體液/血管之間的距離減少到幾百微米以下。在培養過程中，檢測到具有特定幾何形狀的嵌入bioink（褐藻酸鹽和甲基纖維素）中的胰島，其存活率約為80%，葡萄糖反應性長達七天。

此外，3D生物打印技術顺利获得其重建複雜形態和多細胞環境的潛力，在製造具有血管結構的胰島組織樣結構方面發揮了獨特的作用。基於3D海藻酸鈉-明膠生物打印技術，製作了一種具有小鼠胰島（核心）和內皮祖細胞（保護殼）的同軸結構。在這項工作中，3D生物打印被證明可以精確控制多種細胞類型的分佈，這有可能改善血管重建和抑制免疫反應。顺利获得製作微通道，3D生物打印模擬天然血管樹，為胰島灌注充足的氧氣和營養供應。顺利获得3D生物打印，胰腺的dECM被證明是一種很有前途的胰島類器官生物墨水，並且dECM顯示出剪切變稀的行為，這有利於嵌入細胞的存活，因為顺利获得打印噴嘴時剪切應力被釋放。

儘管採用了革命性的生物打印技術方法，人工胰腺製造的改進潛力巨大，但其技術開發的早期階段阻礙了其生產準備過程。需要解決的是

a）合適的bioink：bioink材料的選擇受到嚴格印刷條件的限制，幾乎所有水凝膠都很脆弱，不穩定，無法保證胰島的長期存活。具有良好的生物相容性、適當的生物和物理化學性質的現有標準或商業生物油墨很少

b）打印速度：在當前的生物打印技術中，人體大小的組織和器官需要太長的打印時間，從而影響打印細胞的細胞活力。

用於胰島類器官的脫細胞器官支架

现在，體外建立的胰島類器官受到毫米級大小的限制，限制了在移植中的直接使用。為解決這個問題，可以從人類屍體上製備脫細胞支架，並用分離的器官特異性前體或直接用含有實質、血管和其他輔助細胞類型的類器官進行接種。加上生理上合適的培養方法和生物反應器培養，這些支架可以在體外支持更大器官結構的生長。

人胰島器官晶片

晶片上器官是一個新的概念。與微流控技術結合，類有機物在给予仿生細胞或組織微環境方面具有顯著優勢。與靜態培養相比，微流控技術引入了一種可促進營養物質、氧氣和廢物運輸的灌流，以模擬血液流動。已經開發了一種器官晶片微流控裝置，以促進IPSC和3D胰島類器官胚胎體的形成，這可以改善胰島類器官的功能和成熟。

Walker及其同事顺利获得懸滴分散人類胰島細胞，製備了胰島類器官，並在微流控系統中培養胰島類器官以促進其存活。在接下來的研究中，Oxy晶片被用於支持具有更好的氧氣利用率和胰島功能的主要人類胰島類器官，其中晶片孔的聚（甲基丙烯酸甲酯）基底被透氧全氟烷氧基（PFA）膜取代。微流控平台也可用於創建3D模型，不同類型的細胞保持在分離的隔間內，並顺利获得微通道陣列連接。

與靜態和常規模型（大小不一的天然胰島）相比，動態條件下的胰島類器官可能對藥物（如甲苯磺丁脲和GLP-1）表現出更高的敏感性。總之，胰島類器官與微流控系統相結合將是疾病建模、高通量藥物分析和再生醫學的完美平台。

機械刺激在人胰島類器官構建中的作用

機械刺激對細胞的影響已引起廣泛關注。據報道，機械信號可能會影響β細胞的分化和功能。

在人類胰島類器官的構建中，機械刺激也起着重要作用。細胞聚集產生的幾何結構被認為是胰島類器官生成過程中最直接的機械刺激。Hogrebe及其同事發現，燒瓶3D旋轉培養中的細胞骨架狀態不同於2D貼壁培養，這嚴重影響了β細胞的定向分化。生物材料的存在會對人類胰島類器官產生多種機械刺激，如硬度、地形和機械壓力。生物材料的硬度（楊氏模量）可以調節細胞自聚集，用於人類胰島類器官構建和β細胞分化。β細胞可以感知地形，並將其轉化為生物信號，從而促進體外長期人類胰島培養。

在微流控平台中，剪切應力由流速決定，並影響胰島類器官的形態和功能。檢測到灌注較慢的動態條件可改善大鼠胰島類器官豐富的微絨毛、緊密的細胞連接和增強的葡萄糖反應性，而灌注較高或靜態條件下則相反。

總之，細胞聚集、生物材料和構建人類胰島類器官的技術都可以顺利获得機械刺激影響類器官的存活、分化和功能。现在其機制主要集中在機械損傷引起的細胞死亡，調節YAP、整合素和細胞骨架動力學等機械信號。最適合人類胰島類器官的最佳機械環境尚未確定。在人類胰腺中，胰島被外分泌部分和豐富的血管組織包圍，這些組織可以為胰島给予剛度、地形和機械壓力。

因此，未來人類胰島類器官構建的研究不僅要關注類器官本身，還要分析天然胰島的機械環境。

现在人胰島類器官的开展道路上還存在着三大挑戰：類器官中胰島細胞類型、比例以及空間位置錯亂；類器官的批次、個體之間的巨大差異性；受到免疫排斥、缺氧等因素影響，移植後的胰島類器官存活率低。

胰島類器官可以促進人類胰島的研究，尤其是在人類胰島發育、糖尿病疾病模型和胰島移植領域。自從埃德蒙頓方案首次取得成功以來，胰島並不是移植的唯一來源。近年來，基於幹細胞的糖尿病臨床試驗已經被提出並實施。2014年，ViaCyte提交了人類ESC源性胰腺祖細胞移植治療T1D的首次試驗（NCT02239354）。2021年1月，SEMMA啟動了一項HESC來源的β細胞治療T1D的臨床試驗。

蓬勃开展的人類胰島再生無疑將使再生醫學更接近糖尿病患者，並有望補充遺體胰島的臨床移植需求。

主要參考文獻：

      Lai Jiang, Yiru Shen，Yajing Liu, Lei Zhang，Making human pancreatic islet organoids:          Progresses on the cell origins, biomaterials and three-dimensional technologies，                Theranostics 2022, Vol. 12, Issue 4：: 1537-1556