【前沿】

近期，由復旦大學附屬中山醫院顏志平教授團隊在《Biomaterials》【IF：12.8】發表了題為「Hypoxia-actived cascade nanovaccine for synergistic chemoembolization-immune therapy of hepatocellular carcinoma（缺氧激活的級聯納米疫苗用於肝細胞癌的協同化學栓塞-免疫治療）」的文章。

研究發現，使用取得中美兩國藥監局批准的藥用輔料及原料藥的3D TableTrix® 微載體作為化學栓塞劑，已被證實可以減緩原位腫瘤的體積增長，並一定程度延長肝細胞癌（HCC）模型動物的生存時間。

在此基礎上，將納米疫苗整合到3D微載體中（即，TRZM），可以顯著增強對HCC的治療效果：微載體表現出良好的載藥性和外周動脈閉塞特性，而納米疫苗則能夠激發免疫細胞滲入腫瘤組織內並激活免疫反應，促進腫瘤細胞的凋亡，從而在物理阻斷的基礎上增加了一種生物治療機制。

儘管栓塞治療可能會在短期內引起肝功能的一些波動，但研究表明，顺利获得血管內途徑給藥的3D微載體或納米疫苗對腎功能和其他關鍵器官的功能沒有顯著的（負面）影響。這表明該聯合療法在提高療效的同時，也保持了較好的安全性和耐受性，為HCC患者给予了一種新的治療選擇。

圖1. 研究設計示意圖：TRZM的合成路徑，以及其作為功能性栓塞劑治療兔VX2肝癌模型

原文連結：

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224000140#undfig1

【Part 1 研究背景】

肝細胞癌（HCC）是一種常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率不断居高不下。现在治療HCC的主要方法涵蓋外科手術（如腫瘤切除和肝臟移植）、局部治療和系統治療。其中外科手術在早期HCC患者中效果顯著，但由於肝癌具有隱蔽性且擴散速度快，許多患者都未能及時接受手術治療。在系統治療領域，免疫檢查點抑制劑（ICIs）已在晚期HCC的治療中顯示出潛力，並且基於納米技術的新型藥物遞送系統正在被廣泛研究，以提高免疫治療的療效。此外，經導管動脈化療栓塞術（TACE）作為一種局部治療方法，顺利获得微創手段將高濃度藥物直接輸送至腫瘤部位，有效降低了藥物的全身性副作用，並利用栓塞材料切斷腫瘤的血液供應，達到「餓死」癌細胞的目的。

顺利获得結合系統治療和局部治療的優勢，可以開發一種新型的「雞尾酒」療法——將納米疫苗整合到化學栓塞劑中。這種創新療法不僅能夠提升HCC的治療效果，還可能在未來的臨床實踐中得到更廣泛的應用。顺利获得這種方式，可以更有效地激活患者自身的免疫系統，同時利用化學栓塞劑的物理作用，共同對抗HCC，為患者帶來新的治療希望。

【Part 2 研究內容】

2.1 納米疫苗的製備與抗腫瘤療效驗證

該研究第一时间對納米疫苗進行了製備。

據報道，替拉扎明（Tirapazamine, TPZ）是一種缺氧激活的前藥，可以顺利获得細胞內還原酶代謝產生高反應性自由基，能夠在缺氧環境中誘導DNA鏈斷裂和拓撲異構酶II毒性。研究表明TPZ可以顺利获得誘導細胞周期停滯和下調缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達來改善腫瘤微環境。

雷西莫特（Resiquimod, R848）是一種TLR 7/8雙激動劑，此前已報道R848在促進抗腫瘤免疫方面具有高效力，並且在其促進樹突狀細胞（DCs）成熟和腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）從M2向M1極化方面有更大的參與。

由有機配體及其配位的金屬離子/離子簇組成的金屬有機框架（MOFs）已被越來越多地應用於納米載藥。其中，得益於高孔隙率、易於製備、可調節的孔徑和高效的藥物封裝等特性，沸石咪唑酯骨架材料-8（Zeolitic imidazolate framework – 8, ZIF-8）作為癌症治療的載體是特別有利的。

該研究將TPZ和R848分別封裝在納米顆粒ZIF-8的框架中（後文分別表示為TZ和RZ，混用時記為TRZ），召开了抗腫瘤驗證。在體外試驗中，給藥24小時後的Huh-7細胞在常氧環境下細胞活率降低至68.0%，在缺氧環境下則能降低至29.1%，並經細胞凋亡試驗驗證，TRZ處理組在缺氧環境下誘發的細胞凋亡率高達75.3%。

為分析研究原位給藥後的腫瘤微環境，該研究檢測了給藥7天後腫瘤組織中的免疫細胞，發現TRZ處理組的小鼠腫瘤組織中，總體免疫細胞（CD45+）增多至33.04%，其中細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）較其他處理組顯著增加，並且M1表型的TAMs顯著增多。該研究還引入了一個雙側皮下的腫瘤模型，將小鼠背部左側的腫瘤指定為「原發腫瘤」，用於原為注射給藥，右側的腫瘤則指定為「遠端腫瘤」，不作處理，實驗設計如下圖A。經監測，原位注射TRZ可以有效減緩原發腫瘤（下圖B）和遠端腫瘤（下圖C）的生長，即發揮遠端作用，與此同時小鼠體重沒有明顯變化（下圖D）。在該過程中，遠端腫瘤組織內的腫瘤浸潤性T淋巴細胞（TILs）顯著增多（下圖E-G），並且血清中的TNF-α、IFN-γ、IL-6等細胞因子有顯著提升（下圖H-J），說明納米疫苗引發了全身性的免疫激活。

以上結果表明，局部注射納米疫苗TRZ可以有效激活腫瘤微環境，募集更多TILs侵入腫瘤組織內，在原位和遠端腫瘤中發揮抗腫瘤效應。

2.2 功能性栓塞劑TRZM的製備與抗腫瘤療效驗證

隨後，該研究引入了3D TableTrix® 微載體（M）作為栓塞劑和載藥平台進行應用。將製備好的納米疫苗與1 mg/mL3D微載體M在生理鹽水中共同攪拌2小時，從而製備載藥後的微載體（標記為TRZM）。從掃描電鏡下可以觀察到納米疫苗吸附在微載體M的孔洞表面，結合EDS能譜分析則可以進一步觀察到納米顆粒ZIF-8中的鋅元素（Zn）富集到了3D微載體M上，佐證了3D微載體M對於納米疫苗的裝載能力。

圖3. 納米疫苗可裝載到3D微載體M

該研究在兔VX2肝癌模型中，顺利获得TACE手段將空3D微載體M或裝載納米疫苗的微載體（RZM、TZM、TRZM）注射到腫瘤供血動脈中，顺利获得數字減影血管造影（DSA）表徵術後腫瘤區域的血管幾乎全部停止血供（下圖B）。顺利获得超聲成像監測術後15天內的腫瘤大小，發現血管內單獨注射的納米疫苗TRZ對原位腫瘤的抗腫瘤效果不如TACE的空載體M，而相比之下，聯合療法TRZM則能顯着地抑制腫瘤生長，並且將模型兔的生存期延長至60天以上（下圖C-E）。此外，TRZM還能顯著抑制腫瘤向肺部和腹腔內的轉移。以上結果表明，3D微載體M表現出良好的載藥性和外周動脈閉塞特性，用TRZM治療HCC模型對原位腫瘤和遠端腫瘤都可以起到非常有效的系統性抗腫瘤療效。

圖4. TRZM在兔VX2肝癌模型中的抗腫瘤效應

為探究TRZM的抗腫瘤機制，該研究對腫瘤樣本深入進行了病理分析。增強CT的結果與超聲成像一致，TRZM組的原位腫瘤體積最小（下圖A），Ki67免疫組化也顯示TRZM組的腫瘤細胞增殖最低（下圖C、F）；而H&E染色表明TRZM組的腫瘤細胞壞死最高（下圖B、E），腫瘤區域內的活性氧（ROS）也呈相同趨勢（下圖D、G）；此外，TZM和TRZM還進一步降低了腫瘤區域的血管新生CD31表達。以上結果表明，以裝載納米疫苗的微載體作為栓塞劑的聯合療法可以提高原位腫瘤內的ROS水平，並抑制腫瘤內的血管新生，從而直接發揮對原位腫瘤的抗腫瘤療效。

圖5. TRZM在兔VX2肝癌模型中的抗腫瘤機制

2.3 載體安全性驗證

該研究還分別從體外、體內對載體進行了安全性驗證。

在體外研究中，該研究檢測了納米顆粒ZIF-8（Z）和3D TableTrix® 微載體（M）在不同劑量（0、1、5、10、25、50和100 μg/mL）下的溶血和細胞毒性。儘管納米顆粒Z和微載體M的溶血率隨濃度略有增加，但保持在低於5%的低水平（下圖A）。此外，將納米顆粒Z或微載體M按不同劑量在與HuH-7細胞共孵育24小時，對細胞活性幾乎沒有影響（下圖B）。這些發現表明納米顆粒Z和3D微載體M均具有良好的生物安全性。

圖6. 納米顆粒Z與3D微載體M的體外生物安全性驗證

在體內研究中，顺利获得H&E切片染色沒有發現經血管內給藥的3D微載體M對心、肝、脾、肺、腎等重要器官存在器官毒性或損傷（下圖A）。所有TACE組的ALT、AST指標在術後3-7天內有提高，但在術後15天均回落至基線水平（下圖B、C）；而腎功能指標Cr、BUN則沒有明顯變化（下圖D、E）。TACE會導致一定程度的肝細胞損傷、並對肝功能造成暫時性的影響，這是業內公認的情況。以上結果進一步驗證了3D微載體M和TRZM的生物安全性。

圖7. 納米顆粒Z與3D微載體M的體外生物安全性驗證

【Part 3 研究結論】

該研究成功開發了一種新型的癌症納米疫苗（TRZ）用於HCC模型的治療，可以在缺氧條件下有效誘導腫瘤細胞凋亡；而將3D TableTrix® 微載體作為栓塞劑，在物理上阻斷了腫瘤的血液供應，從而限制了腫瘤的生長。聯合納米疫苗與微載體M用於TACE治療HCC模型，對原位腫瘤的生長和遠端腫瘤的轉移起到了高效的抑制作用。該研究為將介入治療與免疫治療相結合的「雞尾酒」療法给予了一個重要思路，這在HCC的臨床治療中具有巨大的潛力。

【Part 4 研究團隊】

本文通訊作者為復旦大學附屬中山醫院介入治療科的顏志平教授、劉凌曉主任醫師、復旦大學科学生命學院曹勇斌博士。

顏志平教授（主任醫師）：

• 復旦大學附屬中山醫院介入治療科主任，國家放射與治療臨床研究中心副主任。

• 擅長腫瘤及外周血管疾病的介入治療。在國內第一时间對門脈高壓直接性門體分流進行了系統研究，上世紀在國內率先召开90Y玻璃微球治療肝癌的實驗及臨床研究。國際首創「125I粒子條腔內植入術」治療門脈、下腔靜脈及膽道惡性梗阻。

•主持多項國家級及省部級科研課題。國內外期刊發表學術論文120餘篇，取得多項專利。

• 曾獲中華醫學科技二等獎、國家科技進步二等獎、上海市科技進步一等獎、上海市科技進步三等獎、上海醫學科技獎三等獎、上海市優秀髮明銀獎等。

【Part 5 研究技術支持】

①更仿生：由數萬顆彈性三維多孔微載體組成，孔隙率>90%，粒徑大小可控於50-500μm區間， 均一度≤100μm，形成真正的3D仿生培養。

②資質全：該產品已取得2項CDE藥用輔料資質，登記號為【F20200000496；F20210000003】，3項FDA原料藥及藥用輔料資質，登記號為【DMF：037798、035481；MF：29721】

③易收穫：特異性降解技術裂解微載體，收穫相較於傳統方式更高效更溫和。

④更安全：擁有權威组织出具的裂解殘留檢測、細胞毒性、熱原反應、遺傳毒性、體內免疫毒理學相關質量評價報告以及溶血性、皮下注射局部刺激性、主動全身過敏性、腹腔注射給藥毒性等安全性評價報告。

⑤易放大：顺利获得3D培養方式，結合韦德国际生物3D細胞智造平台全線產品可以實現全自動封閉式大規模細胞培養，實現百億量級細胞收穫。

【韦德国际生物】