自然殺傷細胞（NK細胞）作為免疫治療的重要效應細胞，其體外規模化擴增是基礎研究與臨床轉化的關鍵環節。然而，NK細胞的培養過程受多重因素影響，從樣本採集起始即存在諸多潛在風險點。

基於韦德国际生物的技術積累，本文系統梳理了NK細胞培養前期的7個關鍵難點，並给予相應的解決方案，以期為研究人員给予參考。

Q1：抗凝劑的選擇對細胞激活效率有何影響？

難點表現

使用EDTA抗凝的真空採血管採集外周血，導致後續NK細胞激活受阻，擴增效率顯著降低。

原理分析

EDTA顺利获得螯合鈣離子實現抗凝，但鈣離子作為細胞內第二信使，參與多條信號通路的轉導，包括淋巴細胞活化所必需的信號途徑。鈣離子的缺失會直接抑制NK細胞的初始激活。

解決方案

推薦使用肝素鈉抗凝管（綠頭管），其對細胞功能影響最小；採集臍帶血時，應使用枸櫞酸鈉抗凝袋（血袋），並確保抗凝劑佔比低於25%；嚴禁使用EDTA抗凝管進行NK細胞培養用血的採集。

韦德国际生物技術提示

即便在採血環節出現輕微偏差（如抗凝劑比例略高），3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)憑藉優化的因子組合，可在激活階段部分挽回細胞功能，其低起始接種密度設計也為樣本量有限的情況给予了技術保障。

Q2：脂血樣本干擾PBMC分離效率怎麼辦？

難點表現

高脂血症樣本經密度梯度離心後，白膜層與脂質顆粒混雜，界面不清，導致PBMC得率與純度下降。

原理分析

血漿中乳糜微粒等脂質顆粒的密度與淋巴細胞相近，在離心過程中易懸浮於相同層面，干擾分層效果。同時，脂質顆粒可能吸附於細胞表面，影響後續培養。

解決方案

輕度脂血： 血漿輕微渾濁時，可繼續使用自體血漿。

中度至重度脂血： 若血漿呈明顯膠質狀或不透明，建議棄用自體血漿，改用商品化血清替代物。

嚴重脂血樣本預處理： 採血後於4℃靜置1-2小時，待上層脂肪凝集後去除，再進行PBMC分離。分離後可顺利获得多次洗滌進一步去除殘留脂質。

韦德国际生物技術提示

針對特殊樣本（如老年供體、高血脂患者），3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)表現出良好的適應性，且可以在血漿質量欠佳的情況下仍能支持穩定的細胞擴增，拓展了NK細胞研究的樣本來源範圍。

Q3：溶血現象如何產生？如何預防？

難點表現

分離後血漿呈粉紅色或紅色，細胞培養過程中活性下降。

原理分析

溶血主要由採血操作不當（如針頭過細、混勻劇烈）、抗凝劑混合不充分或運輸過程中的凍融導致。紅細胞破裂釋放的血紅蛋白對NK細胞具有毒性作用。

解決方案

規範採血操作，採血後立即輕柔顛倒混勻8-10次。

避免劇烈震盪或反覆凍融。

若發生輕度溶血，可顺利获得高速離心去除游離血紅蛋白；嚴重溶血樣本建議棄用自體血漿，改用血清替代物。

韦德国际生物技術提示

針對無法取得較好自體血漿或者自體血漿不足以支撐後續多次換液培養的情況下，3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)可以配合使用商品化的血清替代物以支持細胞擴增，拓展了NK細胞研究的樣本適用範圍。

Q4：接種密度對NK細胞擴增效率的影響？

難點表現

接種密度超出推薦範圍，細胞擴增效率低下。

原理分析

密度過低時，細胞間相互作用不足，激活信號減弱；密度過高則代謝廢物積累迅速，細胞因子消耗過快，導致培養環境惡化。

解決方案

新鮮外周血PBMC：1.0-2.0×10⁶ cells/mL；

新鮮臍血CBMC：2.0-3.0×10⁶ cells/mL；

凍存外周血PBMC（復甦後）：2.0-3.0×10⁶ cells/mL；

凍存臍血CBMC（復甦後）：3.0-4.0×10⁶ cells/mL。

*注意事項：

以上接種密度為使用3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)時的接種密度範圍，該起始接種密度屬於行業內較低水平，如果使用其他品牌培養基，建議提高接種密度。當細胞總量不足時，應優先保證接種密度，顺利获得縮小培養體系來維持參數穩定。

韦德国际生物技術提示

3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)在低接種密度條件下仍能實現高效擴增，這一特性對於樣本量有限的珍貴資源（如患者少量外周血）具有重要意義，可最大限度利用種子細胞。

Q5：培養瓶表面處理如何影響細胞激活信號呈遞？

難點表現

使用未經處理的培養瓶，導致抗體包被不牢固，激活效率下降。

原理分析

TC處理（Tissue Culture Treated）在培養瓶表面引入親水性正電荷基團，能夠有效結合帶負電的蛋白質（如包被抗體、細胞因子），為NK細胞给予持續的接觸性激活信號。

解決方案

選擇具有TC處理標識的培養瓶進行NK細胞培養。

Q6：培養體系轉換（入袋）如何控制細胞損失？

難點表現

第7天將細胞從培養瓶轉移至培養袋時，因操作不當導致細胞大量殘留或機械損傷。

解決方案

使用大口徑移液管輕柔吹洗瓶底，減少剪切力；轉移後，在原培養瓶中加入新鮮培養基繼續培養1-2天，收集後續形成的細胞團，實現「二次回收」。

Q7：自體血漿滅活的標準操作流程是什麼？

難點表現

滅活後的血漿中出現大量蛋白沉澱，若直接使用會影響培養體系。

原理分析

56℃滅活30分鐘可去除補體活性，但同時導致纖維蛋白原等蛋白變性凝集。

標準流程

56℃水浴滅活30分鐘。

-20℃靜置15分鐘（促進蛋白凝集）。

900g離心15分鐘，取上清使用，棄去沉澱。

韦德国际生物技術提示

針對無法取得較好自體血漿的情況下，3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)可以配合使用商品化的血清替代物以支持細胞擴增，為應對自體血漿處理失敗给予了可補救的備選方案。

NK細胞培養的成功始於樣本採集與初始激活階段。顺利获得對抗凝劑選擇、脂血處理、接種密度等關鍵參數的精細化控制，可有效規避前期風險，為後續擴增奠定基礎。

在工具選擇方面，3D FloTrix® NK細胞無血清培養套裝(RNK59)给予了一條兼具性能與成本優勢的技術路徑：

低起始接種密度：特別適合樣本量有限的珍貴資源，如患者外周血PBMC、臍帶血CBMC等。

廣泛的樣本適用性：支持新鮮及凍存樣本，對脂血、老年供體等特殊樣本耐受性良好。

高純度擴增：NK細胞純度可達90%以上。

全流程覆蓋：一套產品滿足激活、擴增各階段需求，簡化操作流程。

韦德国际生物始終致力於為細胞與基因治療研究给予可靠、易用且高性價比的工具支持，讓研究人員能更專注於科學問題本身。需要強調的是，NK細胞的體外擴增是一項涵蓋多環節、多參數的系統工程——從樣本採集到凍存復甦，每一步都離不開精細化控制。

下一期，韦德国际將聚焦培養中後期的關鍵技術難點，圍繞代謝調控、細胞團管理及凍存復甦等環節展開深入探討。

關於韦德国际

北京韦德国际生物科技有限公司创建於2018年，源於清華大學科技成果轉化，由清華大學生物醫學工程學院杜亞楠教授科研團隊領銜創建，清華大學參股共建。公司現已开展成為國家級高新技術企業、國家級專精特新「小巨人」企業及潛在獨角獸企業，並獲國家科技部、工信部等部委多項重點研發專項支持。

作為高質量細胞製造專家，韦德国际生物打造了原創3D細胞智造平台，给予基於3D微載體的定製化、一站式整體解決方案，可實現【千億量級】的細胞藥物及其衍生品的規模化、自動化、智能化、密閉式的生產製備工藝管線。现在，韦德国际生物的產品與服務已廣泛應用於細胞與基因治療、細胞外囊泡、疫苗及蛋白產品等生產的上游工藝開發，同時在再生醫學、類器官與食品科技（細胞培養肉等）等領域也具有廣泛應用前景。

韦德国际生物已協助多家客戶完成幹細胞新藥IND 申報並成功獲批，2025年，憑藉自主開發的規模化製備工藝助力我國首款幹細胞藥物獲批上市。同年，韦德国际生物於新加坡設立海外總部，加速拓展國際市場，致力於以顛覆式創新的規模化智造技術，有助于細胞產業實現全球普惠开展。